论文部分内容阅读
【摘 要】 目的： 建立山芝麻中β-谷甾醇的定性和定量分析方法。 方法： TLC法对山芝麻中的β-谷甾醇进行定性鉴别，HPLC法测定β-谷甾醇的含量。 结果 ：TLC斑点清晰，重复性好。β-谷甾醇在3.694～184.7 μg/mL（r=0.9999）范围内线性关系良好;平均加样回收率为96.0%（RSD=1.17%）。 结论 ：该方法可应用于山芝麻的质量控制。
【关键词】 山芝麻;β-谷甾醇;TLC;HPLC
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2020）11-0040-03
Qualitative and Quantitative Analysis of β-sitosterol in Radix Helicteris
CHEN Gui XIA Jizi XU Zuogang
Qiannan Institute for Inspection and Testing， Duyun 558000， China
Abstract： Objective To establish a method for qualitative and quantitative analysis of β-sitosterol in Radix helicteris. Methods The qualitative analysis of β-sitosterol was carried out by thin layer chromatography （TLC）. The content determination of β-sitosterol was using high performance liquid chromatography （HPLC）. Results The TLC spots were clear and reproducible. β-sitosterol showed a good linear relationship within the range of 3.694～184.7 μg/mL （r=0.9999）， whose average recovery was 96.0% with the RSD of 1.17%. Conclusion The method can be used for the quality control of Radix helicteris.
Key words： Radix helicteris; β-sitosterol; TLC; HPLC
山芝麻為梧桐科植物山芝麻Helicteres angustifolia L.的干燥根，具有解表清热、解毒消肿的功效，用于感冒高热、扁桃体炎、咽喉炎、腮腺炎、皮肤湿疹、痈肿等[1-2]。现代药理研究[3-4]表明，山芝麻具有抗病毒、抗炎、镇痛、抗肿瘤等作用。β-谷甾醇是山芝麻中的一种甾醇类物质，具有降血脂、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用[5-6]。目前还未见山芝麻中β-谷甾醇含量测定的相关报道。本实验通过TLC法对山芝麻中的β-谷甾醇进行定性鉴别，并采用HPLC法对其含量进行测定，为山芝麻的质量控制提供了参考。
1 仪器与材料
LC-2010A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）;AG135型十万分之一电子天平、AL204型万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅（天津泰斯特公司）;SK250LHC型超声波清洗仪（上海科导公司）。山芝麻对照药材（批号：121088-201103），β-谷甾醇对照品（批号：110851-201909，含量以92.7%计），购于中国食品药品检定研究院; G型硅胶板（批号：20180619），青岛海洋化工有限公司生产;甲醇为色谱纯;其余试剂为分析纯。山芝麻药材（批号：20190401、20190501、20190901）购于药材市场，经黔南州检验检测院夏稷子主任药师鉴定为梧桐科山芝麻Helicteres angustifolia L.的干燥根。
2 方法与结果
2.1 TLC鉴别[7-9]
2.1.1 供试品溶液制备 取山芝麻粉末2.5 g，加30 mL三氯甲烷超声处理30 min，过滤后的滤液置水浴上蒸干，残渣用2 mL三氯甲烷使其溶解，即得。
2.1.2 对照药材溶液制备 取山芝麻对照药材2.5 g，同“2.1.1”项下方法制备对照药材溶液。
2.1.3 对照品溶液制备 取β-谷甾醇对照品适量，加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。
2.1.4 鉴别 按《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取以上三种溶液各2 μL，分别点于同一G型硅胶薄层板上，置展开剂为石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（5∶ 1）的展开缸内展开，取出后晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液并在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱在与山芝麻对照药材色谱和β-谷甾醇对照品色谱对应的位置上，显相同的紫红色斑点，TLC色谱图见图1。
2.2 HPLC含量测定
2.2.1 色谱条件[10-11] 岛津InertSustainR 〇 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为甲醇;柱温30 ℃;检测波长210 nm;体积流量1.0 mL/min;进样量为10 μL。在此条件下，β-谷甾醇理论塔板数大于6000，与相邻的成分之间达到基线分离。HPLC色谱图见图2。 2.2.2 对照品储备液的制备 取β-谷甾醇对照品，加入甲醇制成每1 mL含184.7 μg的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取山芝麻粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量后加热回流30 min，放冷，加甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得。
2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下的对照品储备液1 mL置于2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得系列浓度对照品溶液。取“2.2.2”项下对照品储备液及上述5个稀释浓度的溶液测定峰面积。以β-谷甾醇对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，绘制工作曲线，得回归方程Y=2676.7X+2649.8（r=0.9999），线性范围为3.694～184.7 μg/mL，标准曲线图见图3。
2.2.5 精密度试验 取“2.2.4”项下稀释至10 mL的对照品溶液，照“2.2.1”项下的条件重复进样6次，记录β-谷甾醇的峰面积，结果RSD为0.65%。表明仪器的精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 取山芝麻样品（批号：20190501），照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8和12 h照“2.2.1”项下条件测定β-谷甾醇的含量。结果其含量的RSD为2.73%。表明供试品溶液在制备后12 h内稳定。
2.2.7 重复性试验 取山芝麻样品（批号：20190501），照“2.2.3”项下的方法制备6份供试品溶液，照“2.2.1”项下的条件测定。结果测得6份供试品中β-谷甾醇含量的平均值为0.188 mg/g，RSD为1.84%。表明该方法具有良好的重复性。
2.2.8 加样回收率 取β-谷甾醇对照品，加甲醇制成每1 mL含18.47 μg的加样回收用储备液。取山芝麻样品（批号：20190501）粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，精密加入上述加样回收用储备液10 mL，再精密加入甲醇15 mL，称定重量后加热回流30 min，放冷，加甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，制得加样回收供试品溶液，照“2.2.1”项下的条件进行测定，计算β-谷甾醇的加样回收率。结果见表1。
2.2.9 样品测定 分别取批号为20190401、20190501 和20190901的山芝麻样品，各批次均照“2.2.3”项下方法平行制备3份供试品溶液，照“2.2.1”项下条件，外标法测定β-谷甾醇的含量，结果见表2。
3 讨论
3.1 TLC展开剂比例的选择 实验考察了石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯不同比例（5∶ 1、7∶ 1和9∶ 1）的影响，结果三种展开剂比例下β-谷甾醇的Rf值分别为0.43、0.30和0.24，当展开剂比例为5∶ 1时，β-谷甾醇Rf值适中，且与相邻斑点有更好的分离度，故选择展开剂比例为5∶ 1。
3.2 HPLC检测波长的选择 实验在200～400 nm波长范围内对β-谷甾醇进行了光谱扫描，结果在此范围内β-谷甾醇均无最大吸收，在低波长下有较大吸收。实验比较了检测波长（205、208和210 nm）的影响，结果在210 nm下基线较其他两个波长更平稳，因此实验选择210 nm作为HPLC檢测波长。
3.3 HPLC提取条件的选择 实验考察了提取方式、提取时间对样品中β-谷甾醇提取的影响。在提取时间均为30 min的情况下，超声提取所得β-谷甾醇含量为加热回流提取的84.7%;采用加热回流提取，不同提取时间（15、30和45 min）所得β-谷甾醇的含量分别为0.178、0.184和0.185 mg/g。因此，实验选择加热回流提取30 min作为β-谷甾醇HPLC测定的提取条件。
本实验建立的TLC方法在3批次山芝麻样品中重复性好，所得β-谷甾醇斑点清晰，且与相邻斑点分离度良好;采用HPLC法测定β-谷甾醇的含量，方法操作简单，结果准确可靠，可应用于山芝麻的质量控制。
参考文献
[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：人民卫生出版社，1978：45.
[2]广东省食品药品监督管理局.广东省中药材标准（第1册）[M].广州：广东科技出版社，2004：16-17.
[3]黄必奎.山芝麻化学成分与药理作用研究概况[J].广西中医药大学学报，2013，16（2）：129-131.
[4]金孝勤，庞素秋.山芝麻中化学成分与抗肿瘤活性研究[J].安徽医药，2016，20（1）：34-37.
[5]肖志彬，贾韩学，刘小雷.β-谷甾醇药理活性的研究现状[J].世界最新医学信息文摘，2015，15（8）：66-68.
[6]黄秀芳，庾国桢，童晶晶.基于网络药理学分析陈皮的药理作用机制[J].中成药，2019，41（12）：3038-3045.
[7]曾祥腾，何燕，李易鹏，等.山芝麻药材及其制剂的薄层色谱研究[J].广东药学院学报，2009，25（4）：363-364.
[8]刘佳，谷炳明，成佳玲.山芝麻质量标准研究[J].中国药品标准，2016，17（3）：171-174.
[9]东知多杰，班玛才仁，多杰，等.常用藏药材丛菔质量标准提升[J].中国民族民间医药，2019，28（24）：37-40，67.
[10] 毕荣璐，孙荣飞，李德勋，等.HPLC法测定不同产地天麻中的β-谷甾醇含量[J].西部林业科学，2014，43（6）：116-119.
[11]刘娟，赵秋艳，李鹏程，等.反相高效液相色谱测定太白泡沙参中β-谷甾醇的含量[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2017，45（1）：61-63，70.
（收稿日期：2020-03-30 编辑：刘 斌）
基金项目： 贵州省中药材、民族药材质量标准研究项目（DBXZYC52029）。
作者简介： 陈贵 （1986-），男，汉族，硕士，副主任药师，研究方向为中药药剂学及中药质量标准。E-mail：chengui211@126.com
【关键词】 山芝麻;β-谷甾醇;TLC;HPLC
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2020）11-0040-03
Qualitative and Quantitative Analysis of β-sitosterol in Radix Helicteris
CHEN Gui XIA Jizi XU Zuogang
Qiannan Institute for Inspection and Testing， Duyun 558000， China
Abstract： Objective To establish a method for qualitative and quantitative analysis of β-sitosterol in Radix helicteris. Methods The qualitative analysis of β-sitosterol was carried out by thin layer chromatography （TLC）. The content determination of β-sitosterol was using high performance liquid chromatography （HPLC）. Results The TLC spots were clear and reproducible. β-sitosterol showed a good linear relationship within the range of 3.694～184.7 μg/mL （r=0.9999）， whose average recovery was 96.0% with the RSD of 1.17%. Conclusion The method can be used for the quality control of Radix helicteris.
Key words： Radix helicteris; β-sitosterol; TLC; HPLC
山芝麻為梧桐科植物山芝麻Helicteres angustifolia L.的干燥根，具有解表清热、解毒消肿的功效，用于感冒高热、扁桃体炎、咽喉炎、腮腺炎、皮肤湿疹、痈肿等[1-2]。现代药理研究[3-4]表明，山芝麻具有抗病毒、抗炎、镇痛、抗肿瘤等作用。β-谷甾醇是山芝麻中的一种甾醇类物质，具有降血脂、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用[5-6]。目前还未见山芝麻中β-谷甾醇含量测定的相关报道。本实验通过TLC法对山芝麻中的β-谷甾醇进行定性鉴别，并采用HPLC法对其含量进行测定，为山芝麻的质量控制提供了参考。
1 仪器与材料
LC-2010A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）;AG135型十万分之一电子天平、AL204型万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅（天津泰斯特公司）;SK250LHC型超声波清洗仪（上海科导公司）。山芝麻对照药材（批号：121088-201103），β-谷甾醇对照品（批号：110851-201909，含量以92.7%计），购于中国食品药品检定研究院; G型硅胶板（批号：20180619），青岛海洋化工有限公司生产;甲醇为色谱纯;其余试剂为分析纯。山芝麻药材（批号：20190401、20190501、20190901）购于药材市场，经黔南州检验检测院夏稷子主任药师鉴定为梧桐科山芝麻Helicteres angustifolia L.的干燥根。
2 方法与结果
2.1 TLC鉴别[7-9]
2.1.1 供试品溶液制备 取山芝麻粉末2.5 g，加30 mL三氯甲烷超声处理30 min，过滤后的滤液置水浴上蒸干，残渣用2 mL三氯甲烷使其溶解，即得。
2.1.2 对照药材溶液制备 取山芝麻对照药材2.5 g，同“2.1.1”项下方法制备对照药材溶液。
2.1.3 对照品溶液制备 取β-谷甾醇对照品适量，加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。
2.1.4 鉴别 按《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取以上三种溶液各2 μL，分别点于同一G型硅胶薄层板上，置展开剂为石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（5∶ 1）的展开缸内展开，取出后晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液并在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱在与山芝麻对照药材色谱和β-谷甾醇对照品色谱对应的位置上，显相同的紫红色斑点，TLC色谱图见图1。
2.2 HPLC含量测定
2.2.1 色谱条件[10-11] 岛津InertSustainR 〇 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为甲醇;柱温30 ℃;检测波长210 nm;体积流量1.0 mL/min;进样量为10 μL。在此条件下，β-谷甾醇理论塔板数大于6000，与相邻的成分之间达到基线分离。HPLC色谱图见图2。 2.2.2 对照品储备液的制备 取β-谷甾醇对照品，加入甲醇制成每1 mL含184.7 μg的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取山芝麻粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量后加热回流30 min，放冷，加甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得。
2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下的对照品储备液1 mL置于2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得系列浓度对照品溶液。取“2.2.2”项下对照品储备液及上述5个稀释浓度的溶液测定峰面积。以β-谷甾醇对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，绘制工作曲线，得回归方程Y=2676.7X+2649.8（r=0.9999），线性范围为3.694～184.7 μg/mL，标准曲线图见图3。
2.2.5 精密度试验 取“2.2.4”项下稀释至10 mL的对照品溶液，照“2.2.1”项下的条件重复进样6次，记录β-谷甾醇的峰面积，结果RSD为0.65%。表明仪器的精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 取山芝麻样品（批号：20190501），照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8和12 h照“2.2.1”项下条件测定β-谷甾醇的含量。结果其含量的RSD为2.73%。表明供试品溶液在制备后12 h内稳定。
2.2.7 重复性试验 取山芝麻样品（批号：20190501），照“2.2.3”项下的方法制备6份供试品溶液，照“2.2.1”项下的条件测定。结果测得6份供试品中β-谷甾醇含量的平均值为0.188 mg/g，RSD为1.84%。表明该方法具有良好的重复性。
2.2.8 加样回收率 取β-谷甾醇对照品，加甲醇制成每1 mL含18.47 μg的加样回收用储备液。取山芝麻样品（批号：20190501）粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，精密加入上述加样回收用储备液10 mL，再精密加入甲醇15 mL，称定重量后加热回流30 min，放冷，加甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，制得加样回收供试品溶液，照“2.2.1”项下的条件进行测定，计算β-谷甾醇的加样回收率。结果见表1。
2.2.9 样品测定 分别取批号为20190401、20190501 和20190901的山芝麻样品，各批次均照“2.2.3”项下方法平行制备3份供试品溶液，照“2.2.1”项下条件，外标法测定β-谷甾醇的含量，结果见表2。
3 讨论
3.1 TLC展开剂比例的选择 实验考察了石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯不同比例（5∶ 1、7∶ 1和9∶ 1）的影响，结果三种展开剂比例下β-谷甾醇的Rf值分别为0.43、0.30和0.24，当展开剂比例为5∶ 1时，β-谷甾醇Rf值适中，且与相邻斑点有更好的分离度，故选择展开剂比例为5∶ 1。
3.2 HPLC检测波长的选择 实验在200～400 nm波长范围内对β-谷甾醇进行了光谱扫描，结果在此范围内β-谷甾醇均无最大吸收，在低波长下有较大吸收。实验比较了检测波长（205、208和210 nm）的影响，结果在210 nm下基线较其他两个波长更平稳，因此实验选择210 nm作为HPLC檢测波长。
3.3 HPLC提取条件的选择 实验考察了提取方式、提取时间对样品中β-谷甾醇提取的影响。在提取时间均为30 min的情况下，超声提取所得β-谷甾醇含量为加热回流提取的84.7%;采用加热回流提取，不同提取时间（15、30和45 min）所得β-谷甾醇的含量分别为0.178、0.184和0.185 mg/g。因此，实验选择加热回流提取30 min作为β-谷甾醇HPLC测定的提取条件。
本实验建立的TLC方法在3批次山芝麻样品中重复性好，所得β-谷甾醇斑点清晰，且与相邻斑点分离度良好;采用HPLC法测定β-谷甾醇的含量，方法操作简单，结果准确可靠，可应用于山芝麻的质量控制。
参考文献
[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：人民卫生出版社，1978：45.
[2]广东省食品药品监督管理局.广东省中药材标准（第1册）[M].广州：广东科技出版社，2004：16-17.
[3]黄必奎.山芝麻化学成分与药理作用研究概况[J].广西中医药大学学报，2013，16（2）：129-131.
[4]金孝勤，庞素秋.山芝麻中化学成分与抗肿瘤活性研究[J].安徽医药，2016，20（1）：34-37.
[5]肖志彬，贾韩学，刘小雷.β-谷甾醇药理活性的研究现状[J].世界最新医学信息文摘，2015，15（8）：66-68.
[6]黄秀芳，庾国桢，童晶晶.基于网络药理学分析陈皮的药理作用机制[J].中成药，2019，41（12）：3038-3045.
[7]曾祥腾，何燕，李易鹏，等.山芝麻药材及其制剂的薄层色谱研究[J].广东药学院学报，2009，25（4）：363-364.
[8]刘佳，谷炳明，成佳玲.山芝麻质量标准研究[J].中国药品标准，2016，17（3）：171-174.
[9]东知多杰，班玛才仁，多杰，等.常用藏药材丛菔质量标准提升[J].中国民族民间医药，2019，28（24）：37-40，67.
[10] 毕荣璐，孙荣飞，李德勋，等.HPLC法测定不同产地天麻中的β-谷甾醇含量[J].西部林业科学，2014，43（6）：116-119.
[11]刘娟，赵秋艳，李鹏程，等.反相高效液相色谱测定太白泡沙参中β-谷甾醇的含量[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2017，45（1）：61-63，70.
（收稿日期：2020-03-30 编辑：刘 斌）
基金项目： 贵州省中药材、民族药材质量标准研究项目（DBXZYC52029）。
作者简介： 陈贵 （1986-），男，汉族，硕士，副主任药师，研究方向为中药药剂学及中药质量标准。E-mail：chengui211@126.com