论文部分内容阅读
摘要 本研究以IGF1R基因作为影响苏禽黄鸡生长性状的候选基因，基因第16外显子单核苷酸多态性采用DNA测序和PCR-SSCP技术进行分析，并与鸡的生产性能进行关联分析。结果表明，共发现2个SNPs位点（C143082G和A143135G），在初生重方面，CC基因型个体的体重显著高于AA、AB、AC、BB和BC基因型个体的体重（P<0.05）。推测IGF1R基因可能是影响鸡体重的主（效）基因或与影响体重主（效）基因紧密连锁。
关键词 苏禽黄鸡；IGF1R基因；16外显子；生产性状；关联
中图分类号 S831 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）16-0224-02
Abstract In this study，IGF1R gene as candidate gene of Suqin yellow chicken growth traits，using DNA sequencing and PCR-SSCP technology to analyze the correlation between IGF1R gene 16 exon SNPs and chicken production performance.The results showed that 2 SNPs loci（C143082G and A143135G）were found，the birth weight of CC genotype individuals were significantly higher than those in AA，AB，AC，BB and BC genotypes（P<0.05）.It was suggested that IGF1R gene might be the main（effect）gene of chicken weight，or it was closely linked to the main（effect）gene.
Key words suqin yellow chicken； IGF1R gene；exon 16；production performance；correlation
類胰岛素生长因子（insulin-like growth factors，IGFs）包含2类受体（IGF1R、IGF2R）、2个多肽类生长因子（IGF1、IGF2）和7种结合蛋白（IGFBP1-7）[1-5]，是重要的生长因子之一。IGF1R对机体胚胎期和出生后生长有着十分重要的生长调节作用，主要表现为免疫调节、淋巴细胞生成、肌肉和骨的生长[6]。鸡IGF1R基因位于10号染色体由单个基因编码，21个外显子构成，mRNA全长4 698 bp，编码1363氨基酸残基[1，7]。现研究已表明IGF1R基因对鸡生长性状有显著效应[8-9]。本研究以苏禽黄鸡为研究对象，以鸡IGF1R基因作为影响生长性状的候选基因[1，10]，通过DNA测序和PCR-SSCP方法的应用分析该基因多态性与生长性状之间的关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验母鸡品种为苏禽黄鸡，采自翔龙禽业有限公司，共150只，采集母鸡血样，待用。同时记录150只母鸡的0、4、8、12、16周龄体重。翅静脉采集血样1.5 mL，肝素钠抗凝，-20℃保存[1-2]。常规苯酚-氯仿法抽提基因组DNA。
1.2 引物设计及PCR扩增
根据GenBank中鸡的IGF1R基因序列（NC_006097）设计第16外显子的引物P16（F：TGACATGTTCTCCCTCTGCTT，R：GCCGTATCAGTCCACCTCAT），引物由上海生物工程有限公司合成。
1.3 PCR扩增
IGF1R基因引物最佳PCR扩增体系如下：DNA 1.5 μL，10×Buffer 3.0 μL，25mmol/L Mg2 2.2 μL，10 pmol/μL上游引物2.0 μL、10 pmol/μL下游引物2.0 μL，10 mmol/L dNTPs 1.3 μL，2U/L Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 13.5 μL，总体系25.0 μL。IGF1R基因引物反应循环参数：95 ℃预变性6 min，95 ℃变性30 s，58.5 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，30次循环，72 ℃延伸10 min，10 ℃保存[1-4]。
1.4 PCR-SSCP分析
在7.0 μL变性缓冲液中加入PCR产物3.0 μL，98 ℃变性10 min，再迅速冰浴5 min。在10%聚丙烯酰胺凝胶中加入变性好的PCR产物点样，140 V电压电泳8～24 h[1-4]。在电泳结束后，进行银染显色并拍照记录结果[1]。
1.5 数据统计分析
为比较鸡IGF1R各基因型之间的差异，特配合下列模型进行最小二乘方差分析。
yij=μ Gi eij
式中，yij、μ、Gi、eij分别为性状测定值、群体平均值、基因型效应、随机残差效应。
采用SPSS统计软件的GLM（General Linear Model）过程完成所有统计分析，采用LSD法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 PCR-SSCP结果
P16引物扩增片段采用PCR-SSCP进行分析。P16扩增片段有AA、AB、AC、BB、BC、CC 6种带型（图1）。
2.2 序列分析结果
AA型与CC型相比在143 082 bp处发生了C→G突变，在143 135 bp处发生了A→G突变；BB型与CC型相比在143 135 bp处发生了A→G突变（图2）。 2.3 IGFIR基因P16位点与生长性状的关联分析
由表1可知，在4、8、12、16周龄体重均没有显著影响（P>0.05），在初生重方面，AA、AB、AC、BB和BC基因型个体的体重小于CC基因型个体的体重，具有显著的差异性（P<0.05）。
3 结论与讨论
在外显子16处发现2个SNP位点（C143082G和 A1431
35G），位点全部位于编码区，突变都未导致氨基酸的改变。雷明明等[8]发现IGF1R基因与生长和屠体性状显著相关，与初生重显著相关（P<0.05）；金崇富等[3]发现IGF-IR基因IGR2-1、IGR2-2（AluⅠ）、IGR2-3、IGR3-2（Hin1Ⅰ）和IGR16（IGR16-1、IGR16-2）位点显著影响着鸡的生长性状（P<0.05）；高凤华等[9]发现肉鸡品系的IGF1R基因对5周龄体重有显著影响（P<0.05）；Moe等[10]发现IGF1R基因多态性与鹌鹑体重具有相关性，对10周龄体重有极显著的影响（P<0.01）。
本研究发现，在4、8、12、16周龄体重均没有显著影响（P>0.05），在初生重方面，CC基因型个体的体重显著高于AA、AB、AC、BB和BC基因型个体的体重（P<0.05）。2个多态位点与生长性状关联分析结果推测IGF1R基因可能是影响鸡体重的主（效）基因或与影响体重主（效）基因紧密连锁[1-2]。
4 参考文献
[1] 金崇富，葛兆建，杨智青，等.鸡IGFBP-3基因多态性及其与生产性能的相关性[J].江苏农业学报，2013，29（5）：1075-1080.
[2] 金崇富，时凯，陈应江，等.鸡胰岛素样生长因子1受体基因G2633-6A、C111014A多态位点的检测及其与生产性状的相关性[J].中国畜牧兽医，2012，39（5）：141-145.
[3] 金崇富，王金玉，赵秀华，等.京海黄鸡IGF1R基因AluⅠ、Hin1Ⅰ多态位点的发现及其与生产性状的相关性[J].中国畜牧杂志，2012，48（3）：10-14.
[4] 金崇富.京海黄鸡IGF-IR、IGFBP-3基因多态性及其与生产性能的相关性研究[D].扬州：扬州大学，2011.
[5] ZHOU Q，LOU Y Z，MIAO Y W，et al.The relationship between blood protein polymer-phism and productive performance of Wuding chicken lineⅠ[J].Journal of Yunnan Agricultural University，2002，17（1）：33-37.
[6] DENLEY A，COSGROVE L J，BOOKER G W，et al.Molecular interacti-ons of the IGF system[J].Cytokine and Growth Factor Reviews，2005，16：421-439.
[7] DE M P，WHITTAKER J.Structure biology of insulin and IGF-Ⅰrecep-tor：implications for drug design [J].Nature View，2002，1：769-783.
[8] 雷明明，彭霞，張细权.鸡IGFI-型受体基因单苷酸多态与鸡生长性能的相关分析[C]//第十次全国畜禽遗传标记研讨会论文集，2006：121-124.
[9] 高凤华，卞立红，李辉，等.鸡IGF1R基因多态性与生长和体组成性状的相关性研究[J].东北农业大学学报，2009，40（1）：77-83.
[10] MOE H H，SHIMOGIRI T，KAMIHIRAGUMA W，et al.Analysis of pol-ymorphisms in the insulin-like growth factor 1 receptor（IGF1R）gene from Japanese quail selected for body weight[J].Animal Genet，2007，38（6）：659-661.
关键词 苏禽黄鸡；IGF1R基因；16外显子；生产性状；关联
中图分类号 S831 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）16-0224-02
Abstract In this study，IGF1R gene as candidate gene of Suqin yellow chicken growth traits，using DNA sequencing and PCR-SSCP technology to analyze the correlation between IGF1R gene 16 exon SNPs and chicken production performance.The results showed that 2 SNPs loci（C143082G and A143135G）were found，the birth weight of CC genotype individuals were significantly higher than those in AA，AB，AC，BB and BC genotypes（P<0.05）.It was suggested that IGF1R gene might be the main（effect）gene of chicken weight，or it was closely linked to the main（effect）gene.
Key words suqin yellow chicken； IGF1R gene；exon 16；production performance；correlation
類胰岛素生长因子（insulin-like growth factors，IGFs）包含2类受体（IGF1R、IGF2R）、2个多肽类生长因子（IGF1、IGF2）和7种结合蛋白（IGFBP1-7）[1-5]，是重要的生长因子之一。IGF1R对机体胚胎期和出生后生长有着十分重要的生长调节作用，主要表现为免疫调节、淋巴细胞生成、肌肉和骨的生长[6]。鸡IGF1R基因位于10号染色体由单个基因编码，21个外显子构成，mRNA全长4 698 bp，编码1363氨基酸残基[1，7]。现研究已表明IGF1R基因对鸡生长性状有显著效应[8-9]。本研究以苏禽黄鸡为研究对象，以鸡IGF1R基因作为影响生长性状的候选基因[1，10]，通过DNA测序和PCR-SSCP方法的应用分析该基因多态性与生长性状之间的关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验母鸡品种为苏禽黄鸡，采自翔龙禽业有限公司，共150只，采集母鸡血样，待用。同时记录150只母鸡的0、4、8、12、16周龄体重。翅静脉采集血样1.5 mL，肝素钠抗凝，-20℃保存[1-2]。常规苯酚-氯仿法抽提基因组DNA。
1.2 引物设计及PCR扩增
根据GenBank中鸡的IGF1R基因序列（NC_006097）设计第16外显子的引物P16（F：TGACATGTTCTCCCTCTGCTT，R：GCCGTATCAGTCCACCTCAT），引物由上海生物工程有限公司合成。
1.3 PCR扩增
IGF1R基因引物最佳PCR扩增体系如下：DNA 1.5 μL，10×Buffer 3.0 μL，25mmol/L Mg2 2.2 μL，10 pmol/μL上游引物2.0 μL、10 pmol/μL下游引物2.0 μL，10 mmol/L dNTPs 1.3 μL，2U/L Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 13.5 μL，总体系25.0 μL。IGF1R基因引物反应循环参数：95 ℃预变性6 min，95 ℃变性30 s，58.5 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，30次循环，72 ℃延伸10 min，10 ℃保存[1-4]。
1.4 PCR-SSCP分析
在7.0 μL变性缓冲液中加入PCR产物3.0 μL，98 ℃变性10 min，再迅速冰浴5 min。在10%聚丙烯酰胺凝胶中加入变性好的PCR产物点样，140 V电压电泳8～24 h[1-4]。在电泳结束后，进行银染显色并拍照记录结果[1]。
1.5 数据统计分析
为比较鸡IGF1R各基因型之间的差异，特配合下列模型进行最小二乘方差分析。
yij=μ Gi eij
式中，yij、μ、Gi、eij分别为性状测定值、群体平均值、基因型效应、随机残差效应。
采用SPSS统计软件的GLM（General Linear Model）过程完成所有统计分析，采用LSD法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 PCR-SSCP结果
P16引物扩增片段采用PCR-SSCP进行分析。P16扩增片段有AA、AB、AC、BB、BC、CC 6种带型（图1）。
2.2 序列分析结果
AA型与CC型相比在143 082 bp处发生了C→G突变，在143 135 bp处发生了A→G突变；BB型与CC型相比在143 135 bp处发生了A→G突变（图2）。 2.3 IGFIR基因P16位点与生长性状的关联分析
由表1可知，在4、8、12、16周龄体重均没有显著影响（P>0.05），在初生重方面，AA、AB、AC、BB和BC基因型个体的体重小于CC基因型个体的体重，具有显著的差异性（P<0.05）。
3 结论与讨论
在外显子16处发现2个SNP位点（C143082G和 A1431
35G），位点全部位于编码区，突变都未导致氨基酸的改变。雷明明等[8]发现IGF1R基因与生长和屠体性状显著相关，与初生重显著相关（P<0.05）；金崇富等[3]发现IGF-IR基因IGR2-1、IGR2-2（AluⅠ）、IGR2-3、IGR3-2（Hin1Ⅰ）和IGR16（IGR16-1、IGR16-2）位点显著影响着鸡的生长性状（P<0.05）；高凤华等[9]发现肉鸡品系的IGF1R基因对5周龄体重有显著影响（P<0.05）；Moe等[10]发现IGF1R基因多态性与鹌鹑体重具有相关性，对10周龄体重有极显著的影响（P<0.01）。
本研究发现，在4、8、12、16周龄体重均没有显著影响（P>0.05），在初生重方面，CC基因型个体的体重显著高于AA、AB、AC、BB和BC基因型个体的体重（P<0.05）。2个多态位点与生长性状关联分析结果推测IGF1R基因可能是影响鸡体重的主（效）基因或与影响体重主（效）基因紧密连锁[1-2]。
4 参考文献
[1] 金崇富，葛兆建，杨智青，等.鸡IGFBP-3基因多态性及其与生产性能的相关性[J].江苏农业学报，2013，29（5）：1075-1080.
[2] 金崇富，时凯，陈应江，等.鸡胰岛素样生长因子1受体基因G2633-6A、C111014A多态位点的检测及其与生产性状的相关性[J].中国畜牧兽医，2012，39（5）：141-145.
[3] 金崇富，王金玉，赵秀华，等.京海黄鸡IGF1R基因AluⅠ、Hin1Ⅰ多态位点的发现及其与生产性状的相关性[J].中国畜牧杂志，2012，48（3）：10-14.
[4] 金崇富.京海黄鸡IGF-IR、IGFBP-3基因多态性及其与生产性能的相关性研究[D].扬州：扬州大学，2011.
[5] ZHOU Q，LOU Y Z，MIAO Y W，et al.The relationship between blood protein polymer-phism and productive performance of Wuding chicken lineⅠ[J].Journal of Yunnan Agricultural University，2002，17（1）：33-37.
[6] DENLEY A，COSGROVE L J，BOOKER G W，et al.Molecular interacti-ons of the IGF system[J].Cytokine and Growth Factor Reviews，2005，16：421-439.
[7] DE M P，WHITTAKER J.Structure biology of insulin and IGF-Ⅰrecep-tor：implications for drug design [J].Nature View，2002，1：769-783.
[8] 雷明明，彭霞，張细权.鸡IGFI-型受体基因单苷酸多态与鸡生长性能的相关分析[C]//第十次全国畜禽遗传标记研讨会论文集，2006：121-124.
[9] 高凤华，卞立红，李辉，等.鸡IGF1R基因多态性与生长和体组成性状的相关性研究[J].东北农业大学学报，2009，40（1）：77-83.
[10] MOE H H，SHIMOGIRI T，KAMIHIRAGUMA W，et al.Analysis of pol-ymorphisms in the insulin-like growth factor 1 receptor（IGF1R）gene from Japanese quail selected for body weight[J].Animal Genet，2007，38（6）：659-661.