目的建立检测柯萨奇病毒(CoxB1、CoxB2、CoxB3)和其他未分型肠道病毒(EV)的四重荧光定量rRT-PCR法。方法用Primer Express 3.0软件设计特异性引物和探针,优化反应体系,评价建立的rRT-PCR法的灵敏度、特异性和重复性,并用该法检测535份病毒性心肌炎患儿粪便标本和43份咽拭子标本,对阳性结果测序验证。结果 rRT-PCR法检测CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他未分型EV灵敏度均达103copies/mL,特异性较高,检测CV均<1.0%。578份临床标本用该法检测EV为153份,其中CoxB1病毒69份,CoxB2病毒18份,CoxB3病毒27份,其他未分型EV 39份。随机选取CoxB1、CoxB2、CoxB3病毒检测阳性样本各10例测序,均与该法的检测结果一致。结论建立的四重荧光定量rRT-PCR法可同时检测并区分CoxB1、CoxB2、CoxB3病毒和其他未分型EV,可用于此类病毒引起的暴发疫情的实验室应急诊断。