研究T-2毒素对大鼠软骨细胞增殖和细胞周期的影响,为T-2毒素致软骨细胞损伤的分子机制研究提供新思路。
方法提取新生Wistar大鼠的原代软骨细胞,通过甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行细胞鉴定。采用细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8)检测不同剂量的T-2毒素[0(对照),1、5、10、20、50、100 μg/L]染毒24 h对软骨细胞增殖的影响,根据细胞存活率选择对照,1、5、10 μg/L(低、中、高剂量)T-2毒素用于后续实验。采用流式细胞术检测细胞周期变化;实时荧光定量PCR法和免疫印迹法分别检测T-2毒素对软骨细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA和蛋白表达水平的影响。
结果随T-2毒素染毒剂量增加(对照,1、5、10、20、50、100 μg/L),软骨细胞存活率降低[(100.00 ± 0.00)%、(93.12 ± 1.66)%、(77.12 ± 1.11)%、(59.44 ± 4.09)%、(46.64 ± 3.86)%、(38.15 ± 3.37)%、(33.79 ± 0.99)%],组间比较差异有统计学意义(F= 139.21,P < 0.05)。1、5、10 μg/L T-2毒素组静止期/DNA合成前期(G0/G1期)细胞[(22.03 ± 0.42)%、(30.54 ± 2.61)%、(36.01 ± 1.51)%]均明显高于对照组[(13.79 ± 1.65)%,P均< 0.05];DNA合成期(S期)细胞[(60.27 ± 3.53)%、(53.88 ± 4.38)%、(49.55 ± 2.49)%]均明显低于对照组[(76.72 ± 4.24)%,P均< 0.05]。对照组,1、5、10 μg/L T-2毒素组PCNA、Cyclin D1 mRNA水平组间比较差异有统计学意义(F= 46.80、17.97,P均< 0.05),其中5、10 μg/L T-2毒素组(0.77 ± 0.13、0.79 ± 0.08,0.60 ± 0.07、0.56 ± 0.05)均明显低于对照组(0.99 ± 0.02、1.01 ± 0.01,P均< 0.05)。5、10 μg/L T-2毒素组PCNA蛋白水平(0.69 ± 0.03、0.49 ± 0.03)均低于对照组(0.92 ± 0.05,P均< 0.05);1、5、10 μg/L T-2毒素组Cyclin D1蛋白水平(0.80 ± 0.06、0.60 ± 0.07、0.33 ± 0.13)均低于对照组(0.95 ± 0.07,P均< 0.05)。
结论T-2毒素可以抑制软骨细胞增殖,其机制可能是通过影响细胞周期蛋白表达,引起细胞周期阻滞,从而抑制DNA合成。