探讨非受体酪氨酸激酶Tec在内毒素/脂多糖(LPS)诱导人肺泡上皮细胞A549促炎性细胞因子白细胞介素8(IL-8)产生中的作用及机制。
方法将人肺泡上皮细胞A549用含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养液常规培养传代，取第2或第3代细胞进行后续实验。(1)取细胞，按随机数字表法分为6组，每组4孔。空白对照组细胞常规培养2 h；单纯LPS组细胞常规培养1 h后加入1 μg/mL的LPS刺激1 h；单纯LFM-A13组细胞于常规培养液中加入75 μmol/L的LFM-A13处理1 h后更换培养液常规培养1 h；25 μmol/L LFM-A13＋LPS组、75 μmol/L LFM-A13＋LPS组、100 μmol/L LFM-A13＋LPS组细胞分别于常规培养液中加入25、75、100 μmol/L的LFM-A13处理1 h后，均更换培养液并加入1 μg/mL的LPS刺激1 h。采用蛋白质印迹法检测各组细胞内Tec的蛋白表达情况，采用酶联免疫吸附测定法检测各组细胞培养上清液中IL-8的含量。(2)取细胞，按随机数字表法分为5组，每组4孔。空白对照组细胞常规培养2 h；小干扰RNA(siRNA)对照＋LPS组细胞用空的慢病毒转染10 h后，于常规培养液中加入1 μg/mL的LPS刺激2 h；Tec mus-298 RNAi＋LPS组、Tec mus-299 RNAi＋LPS组、Tec mus-300 RNAi＋LPS组细胞分别用搭载Tec mus-298 RNAi、Tec mus-299 RNAi、Tec mus-300 RNAi的慢病毒转染10 h后，均于常规培养液中加入1 μg/mL的LPS刺激2 h。采用蛋白质印迹法检测各组细胞内Tec的蛋白表达情况，筛选沉默Tec基因效果最佳的Tec-siRNA。(3)取细胞，按随机数字表法分为4组，每组4孔。空白对照组细胞常规培养2 h；病毒对照组细胞转染空的慢病毒10 h后，常规培养2 h；单纯LPS组细胞于常规培养液中加入1 μg/mL的LPS刺激2 h；Tec-siRNA＋LPS组细胞转染搭载沉默Tec基因效果最佳的Tec-siRNA的慢病毒10 h后，于常规培养液中加入1 μg/mL的LPS刺激2 h。采用蛋白质印迹法检测各组细胞内p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)MAPK的蛋白表达。对数据行单因素方差分析和LSD-t检验。
结果(1)与空白对照组比较，单纯LPS组细胞中Tec蛋白表达明显升高(t＝9.72，P<0.05)，单纯LFM-A13组细胞中Tec蛋白表达无明显变化(t＝4.31，P＝0.05)。与单纯LPS组比较，25 μmol/L LFM-A13＋LPS组、75 μmol/L LFM-A13＋LPS组、100 μmol/L LFM-A13＋LPS组细胞中Tec蛋白表达明显降低(t＝9.72、9.07、16.33，P<0.05或P<0.01)。与空白对照组的(189±22)pg/mL比较，单纯LPS组细胞培养上清液中IL-8含量明显升高[(214±10)pg/mL，t＝2.18，P<0.05]，单纯LFM-A13组细胞培养上清液中IL-8含量无明显变化[(173±43)pg/mL，t＝0.64，P>0.05]。与单纯LPS组比较，25 μmol/L LFM-A13＋LPS组细胞培养上清液中IL-8含量无明显变化[(204±38)pg/mL，t＝0.54，P>0.05]，75 μmol/L LFM-A13＋LPS组、100 μmol/L LFM-A13＋LPS组细胞培养上清液中IL-8含量明显降低[(144±44)、(137±51)pg/mL, t＝3.63、2.55，P<0.05或P<0.01]。(2)与空白对照组比较，siRNA对照＋LPS组细胞中Tec蛋白表达明显升高(t＝14.24，P<0.01)。与siRNA对照＋LPS组比较，Tec mus-298 RNAi＋LPS组、Tec mus-299 RNAi＋LPS组细胞中Tec蛋白表达明显下降(t＝36.03、18.23，P<0.01)，Tec mus-300 RNAi＋LPS组细胞中Tec蛋白表达无明显变化(t＝4.08，P>0.05)。Tec mus-298 RNAi＋LPS组细胞中Tec蛋白表达最低，遂将Tec mus-298 RNAi用于后续实验。(3)与空白对照组的1.16±0.16、0.78±0.11比较，病毒对照组细胞内p38 MAPK和ERK MAPK蛋白表达无明显变化(1.66±0.13、0.89±0.11，t＝11.09、3.60，P>0.05)，单纯LPS组细胞内p38 MAPK和ERK MAPK蛋白表达明显升高(2.83±0.29、1.86±0.37，t＝9.70、7.23，P<0.05)。与单纯LPS组比较，Tec-siRNA＋LPS组细胞内p38 MAPK和ERK MAPK蛋白表达明显下降(0.69±0.16、1.03±0.24，t＝13.78、4.12，P<0.05或P<0.01)。
结论Tec可能通过p38 MAPK、ERK MAPK信号通路介导LPS诱导人肺泡上皮细胞A549促炎性细胞因子IL-8的产生和释放。