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摘要
甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus， MNSV）及瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus， CCYV）近年来在瓜类种植区均大面积发生，危害较为严重，已成为制约甜瓜生产的重要因素。本研究广泛收集疑似感染MNSV及 CCYV的甜瓜病叶，从中提取植物总RNA进行RTPCR扩增，将产物分别连接到pEASYT1 Simple克隆载体上，对含有目的片段的重组子进行测序及比对分析。结果显示得到了与预期结果一致的DNA序列，其扩增产物大小分别为673 bp（MNSV）和877 bp（CCYV）。同源性分析结果表明，MNSV和CCYV寿光分离物的核苷酸序列与中国其他地区或一些国家已报道的分离物同源性达99%～100%。
关键词
甜瓜坏死斑点病毒；瓜类褪绿黄化病毒；RTPCR；序列分析
中图分类号：
S 436.5
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.023
Abstract
Melon necrotic spot virus （MNSV） and Cucurbit chlorotic yellows virus （CCYV） have seriously affected the yield and quality of melons in large melongrowing areas in recent years. In this study， diseased leaves infected by MNSV and CCYV were widely collected from Shouguang， Shandong Province. Total RNA were extracted from these leaf tissues and RTPCR was performed. The PCR products were inserted into pEASYT1 Simple cloning vector， and the expected DNA fragments with the size of 673 bp （MNSV） and 877 bp （CCYV） were sequenced and analyzed by BLAST search in GenBank， respectively. Homology analysis showed that nucleotide sequence of MNSV and CCYV isolates from Shouguang had 99%-100% identity with those isolates from other parts of China or some countries previously reported.
Key words
MNSV；CCYV；RTPCR；sequence analysis
甜瓜（Cucumis melo）是起源于非洲和亚洲热带地区的喜温植物，属葫芦科，是我国重要的经济作物和深受消费者喜爱的水果之一。甜瓜也是山东省寿光市种植面积较大的瓜果品种之一，常年种植达2×103 hm2，其中最有名的是‘玉锦’甜瓜，如今已销往全国各地。但是近年来，各种病虫害，尤其是病毒病对甜瓜危害较重，严重影响了甜瓜的产量和品质，其中，甜瓜坏死斑点病毒及瓜类褪绿黄化病毒在瓜类作物中大面积发生，严重危害了甜瓜等瓜类作物的生长[15]。
甜瓜坏死斑点病毒属于香石竹斑驳病毒属（Carmovirus），除侵染甜瓜外还能够侵染其他多种葫芦科植物，如黄瓜、西瓜、丝瓜、葫芦、南瓜等；其主要通过种子、黄瓜黑头叶甲、土壤真菌—瓜油壶菌及机械磨擦等进行传播[6]；瓜类褪绿黄化病毒属于毛形病毒属（Crinivirus），主要侵染黄瓜、西瓜、甜瓜等瓜类作物，通过烟粉虱以半持久性方式传播[7]。
以RTPCR为基础的分子检测技术已被广泛应用于检测侵染甜瓜以及其他葫芦科作物的病毒[810]。本研究采用RTPCR检测了两种典型症状的甜瓜病样，对于研究寿光以及山东地区甜瓜上病毒的基因结构、流行规律、综合防治对策和抗病育种均具有重要的意义。
1材料和方法
1.1材料
2013-2014年在山东省寿光市的甜瓜种植区，采集了具有典型MNSV和CCYV症状的甜瓜病叶各10份，保存于-80 ℃；两种病毒的阳性对照由山东农业大学植保学院的竺晓平教授提供。
植物RNA提取试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、2× Taq master mix、PCR产物回收试剂盒等购自北京科百奥生物科技有限公司；pEASYT1 Simple克隆试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2病叶总RNA的提取
分别称取采集的甜瓜病叶及健康叶片0.3～0.5 g，利用植物RNA提取试剂盒提取其总RNA。
用于检测MNSV的PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃下继续延伸10 min。
用于检测CCYV的PCR反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃下继续延伸10 min。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6PCR产物的回收及克隆
使用PCR产物回收试剂盒快速回收相应的目的片段，并将其分别与pEASYT1 Simple克隆载体连接，连接产物转入大肠杆菌Trans1T1 感受态细胞中，经菌液PCR鉴定的阳性菌落，送到北京华大基因科技有限公司测序。 1.7序列分析
将测序结果分别在http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi与GenBank中的其他相关基因序列进行相似性比较，并利用DNAstar及MEGA软件分析各分离株的序列同源性及构建亲缘关系的系统发育树。同源性分析所用到的各病毒分离株基因登录号、名称、寄主及其来源地见表1和表2。
2结果与分析
2.1病样调查结果
在山东省寿光市的甜瓜产区分别采集到代表性的甜瓜病样，MNSV的田间症状主要为叶片上产生许多黄色坏死斑点（俗称“米黄点”）（图1a）； CCYV的田间症状主要为叶片出现褪绿，但叶脉仍为绿色（图1b）。
2.2RTPCR检测
以采集的甜瓜叶片总RNA为模板进行RTPCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，感病样品的扩增产物大小分别在673 bp（MNSV，图2）和877 bp（CCYV，图3），与阳性对照的检测结果一致，而健康植株没有得到任何条带。另外，该法对甜瓜样品的阳性检出率分别为60%（MNSV）和80%（CCYV）。
2.3MNSV和CCYV寿光分离物部分序列分析
选择2个供试甜瓜的PCR产物，分别纯化后克隆到pEASYT1 Simple载体，对含有目的片段的重组子进行序列测定，结果表明，MNSV及CCYV寿光分离物的扩增产物分别由673和877个核苷酸组成。
将所得的MNSV寿光分离物（MNSVShouguang）与其他国家或地区分离物核苷酸序列进行比对分析并构建系统发育树（图4），发现其与中国的MNSVHM分离物（GU480022.1）同源性最高，达到100%，而与巴拿马（DQ443546.1）、西班牙（EU848553.1和DQ339157.1）、突尼斯（EF442681.1）和以色列（DQ922807.1）的一些MNSV分离物相似性较高，达到92.2%～93.9%，与日本（AB044292.2、AB189943.1和AB007001.1）、韩国（AB106106.1）及西班牙的Malfa5（AY122286.1）分离物存在着较大的差异，同源性仅为86%～90%，属于不同的分支。
CCYV寿光分离物的同源性分析结果（图5）表明，CCYV寿光分离物（CCYVShouguang）的核苷酸序列与寄主同为甜瓜的中国（JQ904629.1和KJ149806.1）、中国台湾（JF502222.1和JN126046.1）、日本（AB523789.1）的分离物同源性均较高，达到99%，差异较小；而与中国（丝瓜KJ735450.1和西瓜HM581658.1）、苏丹（黄瓜，JF807053.1）和黎巴嫩（黄瓜，JX014262.1）的分离物虽然感染寄主不同，相似性也较高，达到99%左右，可归属为一个大的分支；与伊朗分离物（KC577202.1）核苷酸序列相似性为94.5%，存在一定的差异。
3讨论
甜瓜坏死斑点病毒病和瓜类褪绿黄化病毒病是近几年在甜瓜上发现的两种比较新的病害。随着甜瓜栽培规模和范围的不断扩大，以及设施园艺的推广利用，这两种病毒病的发生范围越来越广泛，危害程度日趋严重，寻找有效快捷的检测方法十分必要。虽然这两种病毒的生物学特性、病毒结构及传播媒介等各不相同，但在大田，尤其保护地种植条件下，两种病毒往往会交替发生，或者对植株造成复合侵染，故将其放在一起进行调查和研究。为了明确供试甜瓜样品感染的病毒种类，本研究分别对各样品进行了MNSV和CCYV的RTPCR检测，基本上排除了两种病毒复合侵染的情况；但在实际生产中复合侵染的现象不容忽视，这也是下一步研究需要关注的问题。
MNSV和CCYV寿光分离物的同源性分析结果表明，其与Gu等[34]报道的中国其他地区的病毒分离物相似性达99%以上，可以推测分别为同一种病毒；MNSV寿光分离物与日本、韩国及西班牙Malfa5分离物的同源性较小，存在着较大的差异，该结论与温少华[8]的研究结果一致；CCYV虽然能够侵染不同的葫芦科作物，但包括寿光分离物在内的各分离物并没有出现基因变异，表现出良好的同源性，整个系统发育树显示CCYV寿光分离物与各地分离物的亲缘关系较近，并未受地缘关系的太大影响。
由MNSV引起的叶片黄色坏死斑点类似于细菌性角斑病的浅黄色斑点，而CCYV引起的叶片褪绿黄化症状与植株缺素症状非常相似，在生产上很容易造成误诊误治，如不及时重点防治，必定造成严重的经济损失。刘珊珊等[9]、Gu等[3]通过RTPCR对河南省和湖南省瓜类褪绿黄化病毒进行了分子鉴定，温少华[8]也对MNSV中国分离物进行了鉴定和序列分析。本研究中甜瓜样品的PCR检测结果，基本与外观表现的感病症状一致，但也发现了疑似感病并未显示阳性的情况，或许是采样时的诊断失误或样品中病毒含量较低造成的，这在田间病样的大量检测中很难避免。因此，建立高效快速的RTPCR检测体系，能有效地监测与控制病毒病的发生及蔓延，为建立早期病毒防控预警技术提供技术支持。
参考文献
[1]
Tomassoli L， Barba M. Occurrence of Melon necrotic spot carmovirus in Italy [J]. EPPO Bulletin， 2000， 30（2）： 279280.
[2]Yakoubi S， Desbiez C， Fakhfakh H， et al. First report of Melon necrotic spot virus on melon in Tunisia [J]. Plant Pathology， 2008， 57（2）：386.
[3]Gu Q S， Liu Y H， Wang Y H， et al. First report of Cucurbit chlorotic yellows virus in cucumber， melon， and watermelon in China [J]. Plant Disease， 2011， 95（1）： 73.
[4]Gu Q S， Bao W H， Tian Y P， et al. Melon necrotic spot virus newly reported in China [J].Plant Pathology，2008，57（4）：765.
[5]Huang L H， Tseng H H， Li J T， et al. First report of Cucurbit chlorotic yellows virus infecting cucurbits in Taiwan [J]. Plant Disease， 2010， 94（9）： 1168.
[6]古勤生， 吴会杰， 彭斌， 等. 瓜类新病毒病害（二）： 甜瓜坏死斑点病[J]. 中国瓜菜， 2011， 24（5）： 3536.
[7]古勤生， 彭斌， 刘珊珊， 等. 瓜类新病毒病害（一）： 瓜类褪绿黄化病[J]. 中国瓜菜， 2011， 24（3）： 3233.
[8]温少华. 甜瓜坏死斑点病毒MNSV中国分离物全基因组序列的克隆和分析[D]. 武汉： 华中农业大学， 2009.
[9]刘珊珊， 彭斌， 吴会杰， 等， 海南省和河南省发生甜瓜褪绿黄化病的分子鉴定[J]. 果树学报， 2013， 30（2）： 291293.
[10]李淑菊， 王惠哲， 霍振荣， 等.利用 RTPCR 对黄瓜病毒病毒原种类进行检测[J].华北农学报， 2004， 19（3）： 100102.
（责任编辑：杨明丽）
甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus， MNSV）及瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus， CCYV）近年来在瓜类种植区均大面积发生，危害较为严重，已成为制约甜瓜生产的重要因素。本研究广泛收集疑似感染MNSV及 CCYV的甜瓜病叶，从中提取植物总RNA进行RTPCR扩增，将产物分别连接到pEASYT1 Simple克隆载体上，对含有目的片段的重组子进行测序及比对分析。结果显示得到了与预期结果一致的DNA序列，其扩增产物大小分别为673 bp（MNSV）和877 bp（CCYV）。同源性分析结果表明，MNSV和CCYV寿光分离物的核苷酸序列与中国其他地区或一些国家已报道的分离物同源性达99%～100%。
关键词
甜瓜坏死斑点病毒；瓜类褪绿黄化病毒；RTPCR；序列分析
中图分类号：
S 436.5
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.023
Abstract
Melon necrotic spot virus （MNSV） and Cucurbit chlorotic yellows virus （CCYV） have seriously affected the yield and quality of melons in large melongrowing areas in recent years. In this study， diseased leaves infected by MNSV and CCYV were widely collected from Shouguang， Shandong Province. Total RNA were extracted from these leaf tissues and RTPCR was performed. The PCR products were inserted into pEASYT1 Simple cloning vector， and the expected DNA fragments with the size of 673 bp （MNSV） and 877 bp （CCYV） were sequenced and analyzed by BLAST search in GenBank， respectively. Homology analysis showed that nucleotide sequence of MNSV and CCYV isolates from Shouguang had 99%-100% identity with those isolates from other parts of China or some countries previously reported.
Key words
MNSV；CCYV；RTPCR；sequence analysis
甜瓜（Cucumis melo）是起源于非洲和亚洲热带地区的喜温植物，属葫芦科，是我国重要的经济作物和深受消费者喜爱的水果之一。甜瓜也是山东省寿光市种植面积较大的瓜果品种之一，常年种植达2×103 hm2，其中最有名的是‘玉锦’甜瓜，如今已销往全国各地。但是近年来，各种病虫害，尤其是病毒病对甜瓜危害较重，严重影响了甜瓜的产量和品质，其中，甜瓜坏死斑点病毒及瓜类褪绿黄化病毒在瓜类作物中大面积发生，严重危害了甜瓜等瓜类作物的生长[15]。
甜瓜坏死斑点病毒属于香石竹斑驳病毒属（Carmovirus），除侵染甜瓜外还能够侵染其他多种葫芦科植物，如黄瓜、西瓜、丝瓜、葫芦、南瓜等；其主要通过种子、黄瓜黑头叶甲、土壤真菌—瓜油壶菌及机械磨擦等进行传播[6]；瓜类褪绿黄化病毒属于毛形病毒属（Crinivirus），主要侵染黄瓜、西瓜、甜瓜等瓜类作物，通过烟粉虱以半持久性方式传播[7]。
以RTPCR为基础的分子检测技术已被广泛应用于检测侵染甜瓜以及其他葫芦科作物的病毒[810]。本研究采用RTPCR检测了两种典型症状的甜瓜病样，对于研究寿光以及山东地区甜瓜上病毒的基因结构、流行规律、综合防治对策和抗病育种均具有重要的意义。
1材料和方法
1.1材料
2013-2014年在山东省寿光市的甜瓜种植区，采集了具有典型MNSV和CCYV症状的甜瓜病叶各10份，保存于-80 ℃；两种病毒的阳性对照由山东农业大学植保学院的竺晓平教授提供。
植物RNA提取试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、2× Taq master mix、PCR产物回收试剂盒等购自北京科百奥生物科技有限公司；pEASYT1 Simple克隆试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2病叶总RNA的提取
分别称取采集的甜瓜病叶及健康叶片0.3～0.5 g，利用植物RNA提取试剂盒提取其总RNA。
用于检测MNSV的PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃下继续延伸10 min。
用于检测CCYV的PCR反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃下继续延伸10 min。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6PCR产物的回收及克隆
使用PCR产物回收试剂盒快速回收相应的目的片段，并将其分别与pEASYT1 Simple克隆载体连接，连接产物转入大肠杆菌Trans1T1 感受态细胞中，经菌液PCR鉴定的阳性菌落，送到北京华大基因科技有限公司测序。 1.7序列分析
将测序结果分别在http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi与GenBank中的其他相关基因序列进行相似性比较，并利用DNAstar及MEGA软件分析各分离株的序列同源性及构建亲缘关系的系统发育树。同源性分析所用到的各病毒分离株基因登录号、名称、寄主及其来源地见表1和表2。
2结果与分析
2.1病样调查结果
在山东省寿光市的甜瓜产区分别采集到代表性的甜瓜病样，MNSV的田间症状主要为叶片上产生许多黄色坏死斑点（俗称“米黄点”）（图1a）； CCYV的田间症状主要为叶片出现褪绿，但叶脉仍为绿色（图1b）。
2.2RTPCR检测
以采集的甜瓜叶片总RNA为模板进行RTPCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，感病样品的扩增产物大小分别在673 bp（MNSV，图2）和877 bp（CCYV，图3），与阳性对照的检测结果一致，而健康植株没有得到任何条带。另外，该法对甜瓜样品的阳性检出率分别为60%（MNSV）和80%（CCYV）。
2.3MNSV和CCYV寿光分离物部分序列分析
选择2个供试甜瓜的PCR产物，分别纯化后克隆到pEASYT1 Simple载体，对含有目的片段的重组子进行序列测定，结果表明，MNSV及CCYV寿光分离物的扩增产物分别由673和877个核苷酸组成。
将所得的MNSV寿光分离物（MNSVShouguang）与其他国家或地区分离物核苷酸序列进行比对分析并构建系统发育树（图4），发现其与中国的MNSVHM分离物（GU480022.1）同源性最高，达到100%，而与巴拿马（DQ443546.1）、西班牙（EU848553.1和DQ339157.1）、突尼斯（EF442681.1）和以色列（DQ922807.1）的一些MNSV分离物相似性较高，达到92.2%～93.9%，与日本（AB044292.2、AB189943.1和AB007001.1）、韩国（AB106106.1）及西班牙的Malfa5（AY122286.1）分离物存在着较大的差异，同源性仅为86%～90%，属于不同的分支。
CCYV寿光分离物的同源性分析结果（图5）表明，CCYV寿光分离物（CCYVShouguang）的核苷酸序列与寄主同为甜瓜的中国（JQ904629.1和KJ149806.1）、中国台湾（JF502222.1和JN126046.1）、日本（AB523789.1）的分离物同源性均较高，达到99%，差异较小；而与中国（丝瓜KJ735450.1和西瓜HM581658.1）、苏丹（黄瓜，JF807053.1）和黎巴嫩（黄瓜，JX014262.1）的分离物虽然感染寄主不同，相似性也较高，达到99%左右，可归属为一个大的分支；与伊朗分离物（KC577202.1）核苷酸序列相似性为94.5%，存在一定的差异。
3讨论
甜瓜坏死斑点病毒病和瓜类褪绿黄化病毒病是近几年在甜瓜上发现的两种比较新的病害。随着甜瓜栽培规模和范围的不断扩大，以及设施园艺的推广利用，这两种病毒病的发生范围越来越广泛，危害程度日趋严重，寻找有效快捷的检测方法十分必要。虽然这两种病毒的生物学特性、病毒结构及传播媒介等各不相同，但在大田，尤其保护地种植条件下，两种病毒往往会交替发生，或者对植株造成复合侵染，故将其放在一起进行调查和研究。为了明确供试甜瓜样品感染的病毒种类，本研究分别对各样品进行了MNSV和CCYV的RTPCR检测，基本上排除了两种病毒复合侵染的情况；但在实际生产中复合侵染的现象不容忽视，这也是下一步研究需要关注的问题。
MNSV和CCYV寿光分离物的同源性分析结果表明，其与Gu等[34]报道的中国其他地区的病毒分离物相似性达99%以上，可以推测分别为同一种病毒；MNSV寿光分离物与日本、韩国及西班牙Malfa5分离物的同源性较小，存在着较大的差异，该结论与温少华[8]的研究结果一致；CCYV虽然能够侵染不同的葫芦科作物，但包括寿光分离物在内的各分离物并没有出现基因变异，表现出良好的同源性，整个系统发育树显示CCYV寿光分离物与各地分离物的亲缘关系较近，并未受地缘关系的太大影响。
由MNSV引起的叶片黄色坏死斑点类似于细菌性角斑病的浅黄色斑点，而CCYV引起的叶片褪绿黄化症状与植株缺素症状非常相似，在生产上很容易造成误诊误治，如不及时重点防治，必定造成严重的经济损失。刘珊珊等[9]、Gu等[3]通过RTPCR对河南省和湖南省瓜类褪绿黄化病毒进行了分子鉴定，温少华[8]也对MNSV中国分离物进行了鉴定和序列分析。本研究中甜瓜样品的PCR检测结果，基本与外观表现的感病症状一致，但也发现了疑似感病并未显示阳性的情况，或许是采样时的诊断失误或样品中病毒含量较低造成的，这在田间病样的大量检测中很难避免。因此，建立高效快速的RTPCR检测体系，能有效地监测与控制病毒病的发生及蔓延，为建立早期病毒防控预警技术提供技术支持。
参考文献
[1]
Tomassoli L， Barba M. Occurrence of Melon necrotic spot carmovirus in Italy [J]. EPPO Bulletin， 2000， 30（2）： 279280.
[2]Yakoubi S， Desbiez C， Fakhfakh H， et al. First report of Melon necrotic spot virus on melon in Tunisia [J]. Plant Pathology， 2008， 57（2）：386.
[3]Gu Q S， Liu Y H， Wang Y H， et al. First report of Cucurbit chlorotic yellows virus in cucumber， melon， and watermelon in China [J]. Plant Disease， 2011， 95（1）： 73.
[4]Gu Q S， Bao W H， Tian Y P， et al. Melon necrotic spot virus newly reported in China [J].Plant Pathology，2008，57（4）：765.
[5]Huang L H， Tseng H H， Li J T， et al. First report of Cucurbit chlorotic yellows virus infecting cucurbits in Taiwan [J]. Plant Disease， 2010， 94（9）： 1168.
[6]古勤生， 吴会杰， 彭斌， 等. 瓜类新病毒病害（二）： 甜瓜坏死斑点病[J]. 中国瓜菜， 2011， 24（5）： 3536.
[7]古勤生， 彭斌， 刘珊珊， 等. 瓜类新病毒病害（一）： 瓜类褪绿黄化病[J]. 中国瓜菜， 2011， 24（3）： 3233.
[8]温少华. 甜瓜坏死斑点病毒MNSV中国分离物全基因组序列的克隆和分析[D]. 武汉： 华中农业大学， 2009.
[9]刘珊珊， 彭斌， 吴会杰， 等， 海南省和河南省发生甜瓜褪绿黄化病的分子鉴定[J]. 果树学报， 2013， 30（2）： 291293.
[10]李淑菊， 王惠哲， 霍振荣， 等.利用 RTPCR 对黄瓜病毒病毒原种类进行检测[J].华北农学报， 2004， 19（3）： 100102.
（责任编辑：杨明丽）