目的 对所发现的2种FⅨ基因的新突变Cys82Ser和Ile288Ser进行体外研究,以探讨血友病B的分子发病机制.方法 克隆野生型PcDNA3.1(-)FⅨwt表达载体质粒,以此为模板,采用大引物法构建PcDNA3.1(-)FⅨM1(Cys82Ser)、PcDNA3.1(-)FⅨM2(Ile288Ser)突变表达载体质粒.采用脂质体法将这3种表达载体质粒分别瞬时转染人胚胎肾293细胞(HEK293细胞)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞),同时以PcDNA3.1(-)空载体质粒为空白对照.经体外培养后获得相应的表达蛋白,所得产物分别采用ELISA法检测蛋白抗原;活性测定检测表达蛋白的FⅨ因子活性;免疫荧光染色法检测蛋白在细胞中的定位情况;RT-PCR法检测各培养细胞的FⅨmRNA水平.结果 2种突变体转染细胞的FⅨmRNA水平与野生型无明显区别.以PcDNA3.1(-)FⅨwt转染细胞裂解液和细胞培养上清液中的FⅨ:Ag为100.0%,细胞培养上清液中的FⅨ:C为100.0%,则PcDNA3.1(-)FⅨM1转染细胞裂解液和细胞培养上清液中的FⅨ:Ag分别为(99.4±4.1)%和(27.1±5.2)%,而细胞培养上清液中的FⅨ:C为(8.5±3.2)%;PcDNA3.1(-)FⅨM2转染细胞裂解液和细胞培养上清液中的FⅨ:Ag分别为(31.7±2.5)%和(5.3±1.8)%,细胞培养上清液中的FⅨ:C＜1%.细胞免疫荧光试验也证实,转染PcDNA3.1(-)FⅨM1的CHO细胞,其荧光强度与转染PcDNA3.1(-)FⅨwt的CHO细胞相当,转染PcDNA3.1(-)FⅨM2的CHO细胞,其荧光强度明显弱于转染PcDNA3.1(-)FⅨwt的CHO细胞.结论 Cys82Ser突变由于改变了FⅨ的EGF-1区的分子空间构象从而可能导致突变蛋白分泌障碍并存在胞内滞留现象;Ile288Ser突变则可能导致突变蛋白分泌障碍或细胞内降解加速从而引起FⅨ活性降低。