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摘要[目的]建立从草豆蔻中分离纯化4种主要有效成分半制备型高效液相色谱法。[方法]使用C18柱（250 mm×25.4 mm I.D.，10 μm），考察了流动相的组成、流速和上样量对分离效果的影响，确定适宜的色谱条件；按制备型色谱条件进行洗脱，根据检测信号在线收集产品流出液，分离所得的馏分经HPLC法进行纯度检测。[结果]适宜的色谱条件是：流动相为甲醇-水梯度洗脱，流速为25 mL/min，上样量为232 mg，检测波长为300 nm。经过一次分离即可得到4种成分，经紫外光谱和核磁共振波谱鉴定4种成分分别为山姜素、松属素、小豆蔻明和桤木酮，经高效液相色谱检测纯度分别为98.7%、99.3%、98.4%和99.1%。[结论]与传统的分离方法相比，该方法具有高效、简便、快速的特点，适用于草豆蔻中主要有效成分的快速制备。
关键词 半制备型高效液相色谱；草豆蔻；有效成分；分离
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）24-127-04
Abstract[Objective] The aim was to develop a semipreparative high performance liquid chromatography （SPHPLC） method for separation and purification of four effective components from Alpinia katsumadai Hayata. [Method] Using C18column （250 mm×25.4 mm I.D.，10 μm），the optimum separation conditions were obtained through investigating the effects caused by the composition and flow rate of the mobile phase and the sample size. Elution was performed by preparative chromatography，product effluent was collected online according to detection signal，the purity of separated fraction was detected by HPLC method. [Result] The suitable conditions were listed as follows：the mobile phase was methanolwater in stepwise elution mode，the flow rate of the mobile phase was 25 mL/min，the sample size was 232 mg，and the detection wavelength was 300 nm. Under the above conditions，four compounds obtained purification through onestep separation. They were identified as alpinetin，pinocembrin，cardamonin and alnustone by ultraviolet spectrum （UV） and nuclear magnetic resonance （NMR） analysis，and the purities of the four compounds were 98.7%，99.3%，98.4% and 99.1% as determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. [Conclusion] Comparing with the traditional separation method，the SPHPLC method developed in the paper has many advantages such as high efficiency，facility，and high speed. And it was suitable for rapid preparation of effective components from A. katsumadai.
Key words Semipreparative high performance liquid chromatography； Alpinia katsumadai Hayata； Active ingredient； Separation
草豆蔻为姜科植物草豆蔻Alpinia katsumadai Hayata的干燥近成熟种子团，气香，味辛，微苦，具有燥湿健脾、温胃止呕的作用，临床上广泛用于治疗寒湿内阻、脘腹胀满冷痛、嗳气呕逆、不思饮食等症[1]。草豆蔻的主要化学成分为黄酮和双苯庚酮类化合物，其中山姜素、松属素、小豆蔻明和桤木酮的含量最高。作为草豆蔻质量控制的主要指标，上述4种物质具有抗炎、抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫力等多种药理作用[2-4]。
近年来，随着对植物的化学成分和药理研究的不断深入[5-7]，关于草豆蔻中活性成分的分离纯化研究也日益增多，其中硅胶柱层析是广泛采用的方法[8]，但该法具有不可逆吸附严重、操作繁琐等缺点。李爱峰等[9]曾使用高速逆流色谱分离纯化草豆蔻中的山姜素和小豆蔻明，但该法在选择两相溶剂系统时缺乏理论指导。因此建立一种相关成分的高效分离纯化方法具有十分重要的意义。该研究建立半制备型高效液相色谱（semi-preparative high performance liquid chromatography，SP-HPLC）从草豆蔻中分离得到4种化合物的新方法，一次分离即可得到4种成分，利用紫外光谱和核磁共振波谱对4种成分进行结构鉴定，利用高效液相色谱对其纯度进行测定。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器。Gelaipu高效液相色谱系统（成都格莱普科技有限责任公司），包括GLP3250高压输液泵、UV-3292紫外检测器及格莱普色谱工作站；Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），包括G1311A高压输液泵、G1315B DAD检测器、G1332A在线脱气机和安捷伦HPLC色谱工作站；Mercury Plus 400 NMR核磁共振仪（美国瓦里安公司）。 C18柱（250 mm×25.4 mm I.D.，10 μm，成都格莱普科技有限责任公司），Spherigel ODS C18柱（250 mm×4.6 mm I.D.，5 μm，大连江申分离科学技术公司）。
1.1.2 主要试剂。用于草豆蔻中有效成分提取的溶剂（甲醇、乙醇）为分析纯（天津市化学试剂三厂），用于SP-HPLC分离纯化和HPLC分离分析的甲醇为色谱纯（山东禹王实业有限公司禹城化工厂），试验用水为二次蒸馏水。
1.1.3 主要药材。草豆蔻药材购于聊城市利民大药店，经鉴定为姜科植物Alpinia katsumadai Hayata的干燥近成熟种子团。
1.2 方法
1.2.1 粗提物的制备。称取草豆蔻药材50 g，粉碎至30目，用10倍量70%乙醇超声提取3次，每次30 min，将提取液过滤、合并，减压浓缩得粗提物3.5 g，用60 mL甲醇溶解，经0.45μm滤膜过滤，备用。
1.2.2 试验方法。取一定量草豆蔻粗提物进行制备型高效液相色谱分离，按制备型色谱条件进行洗脱，根据检测信号在线收集产品流出液，分离所得的馏分经HPLC法进行纯度检测。化合物的结构经UV及NMR得以鉴定。试验中改变流动相的组成，以寻求较短的操作周期以及相邻组分间合理的分离度；通过改变流动相流速，寻求最佳的洗脱液流速，保证较高的分离效率；通过改变上样量寻求最佳的处理能力，保证较高的产量。
2 结果与分析
2.1 HPLC分析条件的优化 在研究过程中首先应建立合适的分析方法对草豆蔻药材的提取物和分离纯化过程中得到的单体成分进行分析。该研究使用Spherigel ODS C18柱（250 mm×4.6 mm I.D.，5 μm），考察了流动相的组成及洗脱模式对分离效果的影响。结果表明，当使用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱（0～25 min，60%～90%甲醇）时，4种目标化合物可以获得良好的分离。对4种目标化合物的紫外光谱进行扫描，发现在300 nm均具有较强的吸收，因此选择300 nm 为检测波长。在上述条件下，草豆蔻粗提物的HPLC图如图1所示。
2.2 SP-HPLC分离条件的优化
2.2.1 流动相的组成。采用C18柱，在上样量58 mg（含58 mg粗提物）、流动相的流速25 mL/min、检测波长300 nm的条件下，考察了流动相的组成及洗脱模式对分离效果的影响。结果发现，采用70%甲醇为流动相，桤木酮的保留时间太长（图2a），若前3种物质洗脱出来以后改用90%甲醇为流动相，可以使桤木酮的保留时间明显缩短（图2b）。分别使用70%、75%、80%甲醇为流动相，考察了甲醇的比例对于前3种物质分离效果的影响（图2b～d），发现当75%甲醇为流动相时，它们的分离度及分离时间均比较理想。因此，确定较适宜的洗脱条件为：甲醇-水梯度洗脱（0～20 min，75%甲醇； 20～21 min，75%～90%甲醇； 21～40 min，90%甲醇）。
2.2.2 流动相的流速。使用C18柱，甲醇-水梯度洗脱（0～20 min，75%甲醇； 20～21 min，75%～90%甲醇； 21～40 min，90%甲醇），上样量为58 mg，检测波长为300 nm，考察了流动相的流速对分离效果的影响。结果表明（图3），当流速为25 mL/min时，分离度及分离时间均比较适宜，此时柱压也不会太大。因此，选择25 mL/min作为最佳流速。
2.2.3 上样量。制备型HPLC为了提高柱产量，一般采用柱超载方式进行操作。通常可以采用2种操作方式来提高处理量：一种是质量超载，即上样体积相同，但增加样品的浓度；另一种是体积超载，即保持样品浓度一定，增加上样体积。该研究采用体积超载方式，在保证样品溶液浓度为58 mg/mL的条件下，考察了上样体积对分离效果的影响。结果表明（图4），随着上样量的增加，相邻两组分间的分离度减小，当上样量到达一定量时，相邻组分无法分离。在58～232 mg范围内，随着上样量的增大，山姜素和松属素的分离度逐渐减小，色谱峰的不对称性增大；当上样量>232 mg时，两组分重叠严重，无法保证目标组分的纯度。因此选择上样量为232 mg，既可以保证产品的纯度，又能提高产量。
2.2.4 SP-HPLC分离纯化草豆蔻中的活性成分。综上所述，使用C18柱分离纯化草豆蔻中活性成分的最佳试验条件为：甲醇-水为流动相梯度洗脱（0～20 min，75%甲醇；20～21 min，75%～90%甲醇；21～40 min，90%甲醇），流速为25 mL/min，上样量为232 mg，检测波长为300 nm。根据图4 d，在5.9～7.1 min处手动收集第1个馏分，在8.7～10.0 min处手动收集第2个馏分，在14.6～16.3 min处手动收集第3个馏分，在26.6～28.0 min处手动收集第4个馏分。各个馏分经减压浓缩除去溶剂，质量分别为25.1、11.3、16.5和19.8 mg。
2.3 化合物的纯度检测及结构鉴定 经SP-HPLC分离纯化收集得到的馏分经减压浓缩后，用甲醇溶解，经HPLC检测纯度分别为98.7%、99.3%、98.4%和99.1%，相应的HPLC图如图5所示。 3 结论
该研究使用C18柱，甲醇-水为流动相，通过考察流动相的组成、流速及上样量对分离效果的影响，优化了分离条件，建立了SP-HPLC分离纯化草豆蔻中有效成分的方法。在优化的试验条件下，一次分离可以得到4种高纯度化合物，经UV和NMR鉴定分别为山姜素、松属素、小豆蔻明和桤木酮。与传统的分离纯化方法相比，该法具有高效、快速、简便的优点，适合于草豆蔻中主要有效成分的快速制备。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：222-223.
[2] 吴珍，陈永顺，王启斌.草豆蔻总黄酮抗氧化活性研究[J].医药导报，2011，30 （11）：1406-1409.
[3] 唐俊，李宁，戴好富，等.草豆蔻种子化学成分及其NF-κB的激活抑制作用与抗肿瘤活性[J].中国中药杂志，2010，35 （13）：1710-1714.
[4] 李元圆，杨莉，王长虹，等.草豆蔻化学成分及体外抗肿瘤作用研究[J].中国药师，2011，14 （12）：1740-1741.
[5] 黄海亮.丹参的化学成分分离及其抗氧化活性研究[J].中国现代药物应用，2015，9 （21）：277-278.
[6] 叶丽香，阮冠宇，李鹏.草豆蔻中总黄酮体外抗肿瘤活性研究[J].海峡药学，2012，24 （6）：263-264.
[7] 季霄，吴士龙，贾天柱，等.肉豆蔻的化学成分研究[J].中草药，2014，45 （23）：3367-3372.
[8] 王小兵，杨长水，华淑贞，等.草豆蔻的化学成分[J].中国天然药物，2011，8 （6）：419-421.
[9] 李爱峰，李晓鹏，孙爱玲，等.高速逆流色谱分离纯化草豆蔻中山姜素和小豆蔻明[J].中草药，2011，42 （4）：687-690.
[10] 陈德昌.中药化学对照品工作手册[M].北京：中国医药科技出版社，2000：47.
[11] 安宁，杨世林，邹忠梅，等.高良姜黄酮类化学成分的研究[J].中草药，2006，37 （5）：663-664.
[12] 陈德昌.中药化学对照品工作手册[M].北京：中国医药科技出版社，2000：58.
[13] 史道华，廖琴，郭丽娇，等.草豆蔻中小豆蔻明提取工艺改进[J].医药导报，2009，28 （8）：1068-1069.
关键词 半制备型高效液相色谱；草豆蔻；有效成分；分离
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）24-127-04
Abstract[Objective] The aim was to develop a semipreparative high performance liquid chromatography （SPHPLC） method for separation and purification of four effective components from Alpinia katsumadai Hayata. [Method] Using C18column （250 mm×25.4 mm I.D.，10 μm），the optimum separation conditions were obtained through investigating the effects caused by the composition and flow rate of the mobile phase and the sample size. Elution was performed by preparative chromatography，product effluent was collected online according to detection signal，the purity of separated fraction was detected by HPLC method. [Result] The suitable conditions were listed as follows：the mobile phase was methanolwater in stepwise elution mode，the flow rate of the mobile phase was 25 mL/min，the sample size was 232 mg，and the detection wavelength was 300 nm. Under the above conditions，four compounds obtained purification through onestep separation. They were identified as alpinetin，pinocembrin，cardamonin and alnustone by ultraviolet spectrum （UV） and nuclear magnetic resonance （NMR） analysis，and the purities of the four compounds were 98.7%，99.3%，98.4% and 99.1% as determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. [Conclusion] Comparing with the traditional separation method，the SPHPLC method developed in the paper has many advantages such as high efficiency，facility，and high speed. And it was suitable for rapid preparation of effective components from A. katsumadai.
Key words Semipreparative high performance liquid chromatography； Alpinia katsumadai Hayata； Active ingredient； Separation
草豆蔻为姜科植物草豆蔻Alpinia katsumadai Hayata的干燥近成熟种子团，气香，味辛，微苦，具有燥湿健脾、温胃止呕的作用，临床上广泛用于治疗寒湿内阻、脘腹胀满冷痛、嗳气呕逆、不思饮食等症[1]。草豆蔻的主要化学成分为黄酮和双苯庚酮类化合物，其中山姜素、松属素、小豆蔻明和桤木酮的含量最高。作为草豆蔻质量控制的主要指标，上述4种物质具有抗炎、抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫力等多种药理作用[2-4]。
近年来，随着对植物的化学成分和药理研究的不断深入[5-7]，关于草豆蔻中活性成分的分离纯化研究也日益增多，其中硅胶柱层析是广泛采用的方法[8]，但该法具有不可逆吸附严重、操作繁琐等缺点。李爱峰等[9]曾使用高速逆流色谱分离纯化草豆蔻中的山姜素和小豆蔻明，但该法在选择两相溶剂系统时缺乏理论指导。因此建立一种相关成分的高效分离纯化方法具有十分重要的意义。该研究建立半制备型高效液相色谱（semi-preparative high performance liquid chromatography，SP-HPLC）从草豆蔻中分离得到4种化合物的新方法，一次分离即可得到4种成分，利用紫外光谱和核磁共振波谱对4种成分进行结构鉴定，利用高效液相色谱对其纯度进行测定。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器。Gelaipu高效液相色谱系统（成都格莱普科技有限责任公司），包括GLP3250高压输液泵、UV-3292紫外检测器及格莱普色谱工作站；Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），包括G1311A高压输液泵、G1315B DAD检测器、G1332A在线脱气机和安捷伦HPLC色谱工作站；Mercury Plus 400 NMR核磁共振仪（美国瓦里安公司）。 C18柱（250 mm×25.4 mm I.D.，10 μm，成都格莱普科技有限责任公司），Spherigel ODS C18柱（250 mm×4.6 mm I.D.，5 μm，大连江申分离科学技术公司）。
1.1.2 主要试剂。用于草豆蔻中有效成分提取的溶剂（甲醇、乙醇）为分析纯（天津市化学试剂三厂），用于SP-HPLC分离纯化和HPLC分离分析的甲醇为色谱纯（山东禹王实业有限公司禹城化工厂），试验用水为二次蒸馏水。
1.1.3 主要药材。草豆蔻药材购于聊城市利民大药店，经鉴定为姜科植物Alpinia katsumadai Hayata的干燥近成熟种子团。
1.2 方法
1.2.1 粗提物的制备。称取草豆蔻药材50 g，粉碎至30目，用10倍量70%乙醇超声提取3次，每次30 min，将提取液过滤、合并，减压浓缩得粗提物3.5 g，用60 mL甲醇溶解，经0.45μm滤膜过滤，备用。
1.2.2 试验方法。取一定量草豆蔻粗提物进行制备型高效液相色谱分离，按制备型色谱条件进行洗脱，根据检测信号在线收集产品流出液，分离所得的馏分经HPLC法进行纯度检测。化合物的结构经UV及NMR得以鉴定。试验中改变流动相的组成，以寻求较短的操作周期以及相邻组分间合理的分离度；通过改变流动相流速，寻求最佳的洗脱液流速，保证较高的分离效率；通过改变上样量寻求最佳的处理能力，保证较高的产量。
2 结果与分析
2.1 HPLC分析条件的优化 在研究过程中首先应建立合适的分析方法对草豆蔻药材的提取物和分离纯化过程中得到的单体成分进行分析。该研究使用Spherigel ODS C18柱（250 mm×4.6 mm I.D.，5 μm），考察了流动相的组成及洗脱模式对分离效果的影响。结果表明，当使用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱（0～25 min，60%～90%甲醇）时，4种目标化合物可以获得良好的分离。对4种目标化合物的紫外光谱进行扫描，发现在300 nm均具有较强的吸收，因此选择300 nm 为检测波长。在上述条件下，草豆蔻粗提物的HPLC图如图1所示。
2.2 SP-HPLC分离条件的优化
2.2.1 流动相的组成。采用C18柱，在上样量58 mg（含58 mg粗提物）、流动相的流速25 mL/min、检测波长300 nm的条件下，考察了流动相的组成及洗脱模式对分离效果的影响。结果发现，采用70%甲醇为流动相，桤木酮的保留时间太长（图2a），若前3种物质洗脱出来以后改用90%甲醇为流动相，可以使桤木酮的保留时间明显缩短（图2b）。分别使用70%、75%、80%甲醇为流动相，考察了甲醇的比例对于前3种物质分离效果的影响（图2b～d），发现当75%甲醇为流动相时，它们的分离度及分离时间均比较理想。因此，确定较适宜的洗脱条件为：甲醇-水梯度洗脱（0～20 min，75%甲醇； 20～21 min，75%～90%甲醇； 21～40 min，90%甲醇）。
2.2.2 流动相的流速。使用C18柱，甲醇-水梯度洗脱（0～20 min，75%甲醇； 20～21 min，75%～90%甲醇； 21～40 min，90%甲醇），上样量为58 mg，检测波长为300 nm，考察了流动相的流速对分离效果的影响。结果表明（图3），当流速为25 mL/min时，分离度及分离时间均比较适宜，此时柱压也不会太大。因此，选择25 mL/min作为最佳流速。
2.2.3 上样量。制备型HPLC为了提高柱产量，一般采用柱超载方式进行操作。通常可以采用2种操作方式来提高处理量：一种是质量超载，即上样体积相同，但增加样品的浓度；另一种是体积超载，即保持样品浓度一定，增加上样体积。该研究采用体积超载方式，在保证样品溶液浓度为58 mg/mL的条件下，考察了上样体积对分离效果的影响。结果表明（图4），随着上样量的增加，相邻两组分间的分离度减小，当上样量到达一定量时，相邻组分无法分离。在58～232 mg范围内，随着上样量的增大，山姜素和松属素的分离度逐渐减小，色谱峰的不对称性增大；当上样量>232 mg时，两组分重叠严重，无法保证目标组分的纯度。因此选择上样量为232 mg，既可以保证产品的纯度，又能提高产量。
2.2.4 SP-HPLC分离纯化草豆蔻中的活性成分。综上所述，使用C18柱分离纯化草豆蔻中活性成分的最佳试验条件为：甲醇-水为流动相梯度洗脱（0～20 min，75%甲醇；20～21 min，75%～90%甲醇；21～40 min，90%甲醇），流速为25 mL/min，上样量为232 mg，检测波长为300 nm。根据图4 d，在5.9～7.1 min处手动收集第1个馏分，在8.7～10.0 min处手动收集第2个馏分，在14.6～16.3 min处手动收集第3个馏分，在26.6～28.0 min处手动收集第4个馏分。各个馏分经减压浓缩除去溶剂，质量分别为25.1、11.3、16.5和19.8 mg。
2.3 化合物的纯度检测及结构鉴定 经SP-HPLC分离纯化收集得到的馏分经减压浓缩后，用甲醇溶解，经HPLC检测纯度分别为98.7%、99.3%、98.4%和99.1%，相应的HPLC图如图5所示。 3 结论
该研究使用C18柱，甲醇-水为流动相，通过考察流动相的组成、流速及上样量对分离效果的影响，优化了分离条件，建立了SP-HPLC分离纯化草豆蔻中有效成分的方法。在优化的试验条件下，一次分离可以得到4种高纯度化合物，经UV和NMR鉴定分别为山姜素、松属素、小豆蔻明和桤木酮。与传统的分离纯化方法相比，该法具有高效、快速、简便的优点，适合于草豆蔻中主要有效成分的快速制备。
参考文献
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