硫氧还蛋白-1小干扰RNA加剧脂多糖诱导的大鼠肝细胞内质网应激

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目的

探讨脂多糖(LPS)诱导大鼠肝细胞内质网应激(ERS)过程中硫氧还蛋白-1(Trx-1)的变化及其作用机制。

方法

①体外培养大鼠肝细胞株BRL,取部分细胞,分别用0.1、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L LPS处理细胞12 h;另取部分细胞,用10.0 mg/L LPS分别处理细胞1、3、6、12、24 h;均以LPS溶剂磷酸盐缓冲液(PBS)为对照,从量效和时效的角度观察LPS对Trx-1蛋白表达和ERS的影响。②体外培养大鼠肝细胞株BRL,分为溶剂对照组、阴性小干扰RNA(siRNA)对照组、Trx-1 siRNA对照组、LPS刺激组、阴性siRNA+LPS组、Trx-1 siRNA+LPS组,Trx-1 siRNA或阴性siRNA转染24 h后用10.0 mg/L LPS作用12 h,观察Trx-1是否参与LPS诱导大鼠肝细胞ERS。用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测Trx-1、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和硫氧还蛋白结合蛋白(TXNIP)的蛋白表达,ERS标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12(caspase-12)以及细胞凋亡执行蛋白caspase-3及其底物多聚二磷酸腺苷聚合酶-1(PARP-1)裂解片段的表达;采用细胞计数试剂盒检测细胞活性。

结果

①与溶剂对照组比较,LPS可诱导大鼠肝细胞Trx-1和TrxR蛋白表达上调、TXNIP蛋白表达下调,引起ERS相关蛋白GRP78、caspase-12上调,抑制细胞活性,且具有一定的剂量和时间依赖效应。②与溶剂对照组比较,除Trx-1及ERS相关蛋白外,LPS还可诱导大鼠肝细胞caspase-3及PARP-1裂解片段明显上调,同时抑制细胞活性;Trx-1 siRNA转染预处理24 h能明显引起大鼠肝细胞Trx-1蛋白表达沉默(A值:0.249±0.017比0.531±0.030,P<0.01),使LPS诱导的ERS及凋亡相关蛋白表达进一步上调〔GRP78(A值):1.247±0.124比0.786±0.048,caspase-12(A值):0.810±0.017比0.578±0.013,caspase-3(A值):0.508±0.008比0.308±0.009,PARP-1裂解片段(A值):0.598±0.013比0.507±0.016,均P<0.01〕,进一步降低肝细胞活性〔(61.79±1.91)%比(75.29±2.05)%,P<0.01〕。

结论

LPS可呈剂量依赖性和时间依赖性上调Trx-1和ERS相关蛋白表达,并导致细胞损伤;Trx-1 siRNA可加剧LPS诱导的大鼠肝细胞ERS和细胞凋亡,说明Trx-1可能参与了LPS导致的ERS和细胞损伤过程。

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