【摘 要】
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目的 筛选糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)患者与单纯2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者尿液外泌体中最优差异表达蛋白,探讨蛋白质组学在T2DM患者DN诊断中的价值.方法 经肾脏穿刺活检组织病理检查确诊的DN患者12例,随机选取4例为DN筛选蛋白组,余8例DN患者为DN蛋白验证组;单纯T2DM不合并肾功能损害患者8例,随机选取4例为T2DM筛选蛋白组,余4例为T2DM蛋白验证组.分别收集DN筛选蛋白组与DN蛋白验证组患者肾脏穿刺活检前及T2
【机 构】
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解放军医学院,北京100853;解放军总医院第一医学中心肾脏病医学部解放军肾脏病研究所肾脏疾病国家重点实验室国家慢性肾病临床医学研究中心肾脏疾病研究北京市重点实验室,北京 100853
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目的 筛选糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)患者与单纯2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者尿液外泌体中最优差异表达蛋白,探讨蛋白质组学在T2DM患者DN诊断中的价值.方法 经肾脏穿刺活检组织病理检查确诊的DN患者12例,随机选取4例为DN筛选蛋白组,余8例DN患者为DN蛋白验证组;单纯T2DM不合并肾功能损害患者8例,随机选取4例为T2DM筛选蛋白组,余4例为T2DM蛋白验证组.分别收集DN筛选蛋白组与DN蛋白验证组患者肾脏穿刺活检前及T2DM筛选蛋白组与T2DM蛋白验证组患者晨起尿液标本,采用超高速离心联合0.22 μm超滤法分离纯化尿液外泌体,应用透射电镜观测尿液外泌体形态特征,采用纳米颗粒跟踪分析尿液外泌体粒径;采用Western blot法检测4组尿液外泌体中经典外泌体识别蛋白ALIX、TSG101、Syntenin、CD9阳性表达情况;采用数据非依赖性采集质谱法鉴定4组患者尿液外泌体蛋白质及其表达量,分析DN筛选蛋白组与T2DM筛选蛋白组肾脏疾病生物途径相关的最优差异表达蛋白;比较DN蛋白验证组与T2DM蛋白验证组最优差异表达蛋白表达量;绘制ROC曲线,评估尿液外泌体最优差异表达蛋白对DN的诊断效能.结果 分离纯化的尿液外泌体均符合尿液外泌体双层膜泡结构特征,符合外泌体粒径,经典外泌体识别蛋白ALIX、TSG101、Syntenin或CD9阳性表达均＞3个,提示尿液外泌体分离纯化成功.DN筛选蛋白组与T2DM筛选蛋白组尿液外泌体中共鉴定出3654个蛋白,差异性表达蛋白1133个,其中DN筛选蛋白组467个蛋白表达较T2DM筛选蛋白组降低-log2 (FC)≤-1,P＜0.05],666个蛋白表达较T2DM筛选蛋白组升高[log2 (FC)≥1,P＜0.05];根据差异表达排名及肾脏疾病生物途径筛选出C8G[log2 (FC)=8.500]、CD5L[log2 (FC)=8.330]、C5 [log2 (FC)=7.570]、C7[log2 (FC)=7.414]、C9[log2 (FC)=6.965]、ANXA1[log2 (FC)=-3.247]、CALB1[log2 (FC)=--2.661]、CLOCK[log2 (FC)=-2.649]为最优差异表达蛋白.DN蛋白验证组患者尿液外泌体CD5L、C5、C9蛋白表达量高于T2DM蛋白验证组(P＜0.05),CALB1、CLOCK蛋白表达量低于T2DM蛋白验证组(P＜0.05);C8G、C7、ANXA1蛋白表达量与T2DM蛋白验证组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).DN与T2DM患者尿液外泌体最优差异表达蛋白CALB1、C9、CD5L、C5表达量最佳截断值分别为0.36×105、1.70×105、0.77×105、1.04×105时,诊断DN的AUC分别为0.969(95％CI:0.876～1.000,P=0.011)、0.906(95％CI:0.720～1.000,P=0.027)、0.906(95％CI:0.733～1.000,P=0.027)、0.938(95％CI:0.796～1.000,P=0.017),灵敏度分别为100.0％、87.5％、75.0％、87.5％,特异度分别为87.5％、100.0％、100.0％、100.0％.结论 蛋白质组学有助于筛选尿液外泌体中与肾脏疾病生物途径相关差异表达蛋白质,CALB1、C9、CD5L、C5可能作为T2DM患者诊断DN的无创生物学标志物.
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