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摘 要：用二氧化氯（ClO2）处理鲳鱼块后进行微冻（-3 ℃）贮藏，测定贮藏期间鱼肉的菌落总数、菌相、总挥发性盐基氮（total volatile basis nitrogen，TVB-N）含量、K值、pH值及肌原纤维储能模量（G’）的变化，考察ClO2处理对鲳鱼块微冻贮藏品质的影响。结果表明：30 μg/mL ClO2处理（料液比1∶20（m/V），浸泡10 min）可以使鱼块的初始菌落总数降低约2 （lg（CFU/g））。贮藏过程中，处理组鱼块的菌落总数始终低于对照组，但贮藏初期处理组鱼块的细菌生长速率明显高于对照组；2 组鱼块的优势腐败菌均由初期的希瓦氏菌属过渡到末期的假单胞菌属；根据鱼肉的TVB-N含量，对照组于贮藏第20天变为二级鲜度，而处理组在贮藏的32 d内一直处于一级鲜度；ClO2处理使鱼肉初始pH值下降0.52，贮藏期间处理组鱼肉的pH值始终低于对照组约0.2～0.4；贮藏期间2 组鱼肉的K值差别不大，对照组和处理组分别于贮藏12、16 d达到40%；处理组鱼肉的肌原纤维蛋白G’峰值始终高于对照组。上述结果表明，ClO2处理结合微冻贮藏能够有效提升鲳鱼块鲜度、延长其货架期。
关键词：鲳鱼；微冻贮藏；ClO2前处理
Abstract： In this paper， pomfret fillet was pretreated with ClO2 and subsequently stored at superchilled temperature （?3 ℃）. During storage， meat quality was evaluated by total plate count （TPC）， microflora， total volatile basic nitrogen （TVB-N） content， K value， pH value and rheological property （storage modulus） of myofibrillar protein. Results showed that treatment with
30 μg/mL ClO2 （1：20 of solid-to-liquid ratio （m/V）， soaking for 10 min） reduced the initial TPC by 2 （lg（CFU/g））. The ClO2 group demonstrated lower TPC than the control throughout the storage period. But during the initial stage， the growth rate of residual bacteria in the ClO2 group was higher than that of the control group. For both groups， the dominant spoilage bacteria were Shewanella and Pseudomonas at the initial and final stages， respectively. According to the TVB-N content， the freshness of the control decreased to second grade after 20 days of storage， whereas that of the ClO2 group remained the same （first grade） throughout the 32-day storage period. ClO2 treatment lowered the pH of fresh fillet by 0.52 and the pH value of the ClO2 group was always 0.2–0.4 lower than that of the control. The K values of the control and ClO2 groups reached 40% on days 12 and 16， respectively， with no significant difference being observed between the two groups during storage. The peak value of storage modulus of myofibrillar protein in the ClO2 group was higher than that of the control during the whole storage period. The above results suggested that the use of ClO2 pretreatment in conjunction with superchilled storage could maintain the freshness and extend the shelf-life of pomfret fillet.
Keywords： pomfret； superchilled storage； chlorine dioxide pretreatment
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802008
中圖分类号：TS254.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）02-0046-06
引文格式：
季晓彤， 年益莹， 薛鹏， 等. 二氧化氯对鲳鱼微冻贮藏品质的影响[J]. 肉类研究， 2018， 32（2）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802008. http：//www.rlyj.pub JI Xiaotong， NIAN Yiying， XUE Peng， et al. Effect of chlorine dioxide on pomfret quality during superchilled storage[J]. Meat Research， 2018， 32（2）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802008. http：//www.rlyj.pub
鲳鱼是我国的主要经济鱼种，2017年中国渔业统计年鉴统计数据表明，我国2016年海洋捕捞鲳鱼总产量达34.6 万t，位居海水捕捞鱼总产量的第9位。鲳鱼不但捕捞量高，而且其养殖技术也获得了突破，近年来我国金鲳的养殖量逐年增长，主要分布在福建、广东、广西、海南等东南沿海地区。鲳鱼肉质细嫩、味道鲜美、无肌间刺，是加工鱼块的优良材料。然而鱼块加工过程破坏了完整的鱼肉组织，将鱼体表和外源性腐败微生物及病原菌引入肉中，极易引起鱼肉的快速腐败变质。
二氧化氯（ClO2）作为世界卫生组织和美国农业部认定的A1级安全、高效的灭菌剂，在国内外得到广泛应用，已经从饮用水消毒、城市污水处理、医疗用品消毒、水产及畜禽疾病防治等领域扩展到食品加工及保鲜领域。水产品由于营养丰富、水分含量高、组织松弛，极易被腐败微生物侵染，导致变质腐败，因此，腐败菌数量和种类的控制一直是水产食品贮藏品质控制的核心目标。ClO2的消毒杀菌作用早已在贝类净化[1-4]、整鱼[5-7]、鱼片[8]、鱼丸[9]、鱼籽[10]、对虾[11-13]、虾肉[14]及其制品[15]
贮藏前的减菌处理方面有较多尝试和应用。Jeongmok等[16]
的研究表明，经ClO2处理后，食品的营养几乎没有改变。因此ClO2可以广泛用于食品的直接处理，我国也在GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中明确规定了ClO2可以作为防腐剂在果蔬保鲜和鱼类加工中使用。
微冻贮藏（又叫部分冻结、过冷却）是一种将水产品温度降低至初始冻结点以下1～2 ℃的轻度冷冻贮藏方法[17]。与4 ℃冷藏相比，微冻贮藏能将产品货架期延长约1.5 倍，与-18 ℃冷冻贮藏相比，微冻贮藏能够减少冷冻造成的汁液流失等问题[18]。
本研究以金鲳鱼块为研究对象，利用ClO2对其进行减菌处理，考察ClO2前处理对鲳鱼块微冻贮藏品质的影响，为鲳鱼块的贮藏保鲜及品质控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冰鲜金鲳（Trachinotus ovatus），体质量（1.0±0.1） kg，
购于大连湾海鲜市场。
ClO2 天津百多春科技有限公司；TTC培养基
青岛海博生物技术有限公司；钙及钙镁-ATP酶测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；Tris、马来酸（maleate）（均为分析纯）、K值测定相关标准品（三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP，纯度98%）、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx，纯度99%）、肌苷（inosine，HxR，纯度99%）） 生工生物工程（上海）股份有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（纯度99%） 美国Sigma公司；二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP，纯度95%）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP，纯度99%）、肌苷酸（inosine monophosphate acid，IMP，纯度99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DHR-1流变仪 美国TA仪器公司；LC-20AD液相色谱仪 日本岛津公司；Autoflex基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）仪 美国Bruker公司；DPR-9162生化培养箱
上海森信实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 原料预处理及ClO2前处理条件的优化
将冰鲜金鲳快速运送至实验室，用自来水洗净表面污物，取背部肌肉，切块，每块约200 g。
配制质量浓度分别为0、10、20、30、40 μg/mL的ClO2溶液，置于4 ℃层析柜中预冷30 min。将鲳鱼块分别置于上述不同质量浓度的ClO2溶液中浸泡10 min，料液比为1∶20（m/V），再用4 ℃无菌去离子水淋洗。对照组鱼块经4 ℃无菌去离子水浸泡、淋洗。测定鱼块的菌落总数，考察不同质量浓度ClO2溶液的减菌效果。
1.3.2 鲳鱼块的微冻贮藏
用1.3.1节确定的较适质量浓度的ClO2溶液对鲳鱼块进行浸泡处理，料液比为1∶20（m/V），浸泡时间为10 min。将鱼块取出后用灭菌的冷去离子水冲洗，洗去残留在鱼块表面的ClO2；对照组鱼块用冷自来水浸泡、淋洗。将鱼块分装于自封袋中，-3 ℃贮藏，于不同时间取样，检测鱼肉的菌落总数、菌相变化、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、pH值、K值及肌原纤维的储能模量（G’）。
1.3.3 微冻贮藏鲳鱼块的指标测定
1.3.3.1 菌落总数
参照GB/T 4789.2—2010《食品安全国家標准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的平板计数法。
1.3.3.2 可培养菌相变化
无菌制备TTC培养基，平板凝固后待用。取鱼肉进行均质，选择适宜的鱼肉均质梯度稀释液涂布于TTC平板上，30 ℃培养48 h；选择菌落总数在50 CFU/g 左右的平板，用无菌竹签挑取单菌落，均匀涂在
MALDI-TOF涂层靶板上；室温自然干燥后，再涂上1 μL基质（10 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸）；室温晾干后，用MALDI-TOF-MS仪进行鉴定，并采用质量分析器对结果进行分析，选择综合评分在2 分以上的鉴定结果。
1.3.3.3 TVB-N含量
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的第三法微量扩散法。
1.3.3.4 pH值
参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》。
1.3.3.5 K值
K值被定义为HxR和Hx的总量之和与ATP及其分解物总量之比的百分率。K值按照下式计算。
根据SC/T 3048—2014《鱼类鲜度指标K值的测定 高效液相色谱法》进行样品处理，采用高效液相色谱法测定鲳鱼肌肉K值。测定条件：COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）[10]；洗脱液为pH 6.0的0.02 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液（KH2PO4与K2HPO4的体积比为1∶1）；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 mL；检测波长254 nm。
1.3.3.6 肌原纤维储能模量
用Tris-maleate（含0.4 mol/L KCl，pH 7）缓冲液将肌原纤维蛋白质量浓度调至20 mg/mL，上样量2 mL，均匀涂抹在上样板上，设定上下板之间的距离为1 mm，温度应变1%，测试频率0.2 Hz，程序升温到20 ℃，之后每隔1 min温度升高1 ℃，记录测试温度为20～80 ℃的数据并分析。
2 结果与分析
2.1 ClO2前处理条件的优化结果
由图1可知，ClO2质量浓度达到30 μg/mL时，鱼块的菌落总数明显下降，当ClO2质量浓度升至40 μg/mL时，减菌效果没有明显增强，因此选择30 μg/mL作为后续鲳鱼块减菌处理的ClO2使用质量浓度。根据食品添加剂使用标准GB 2760—2014的规定，稳定态ClO2可用于水产品及其制品（仅限鱼类加工）中，最大使用量为
0.05 g/kg，即50 μg/mL。因此，30 μg/mL的使用质量浓度符合国家标准要求。
2.2 微冻贮藏鲳鱼块贮藏期间的指标变化
2.2.1 菌落总数
由图2可知：经30 μg/mL的ClO2处理后，鱼块初始菌落总数降低了近2 （lg（CFU/g））；贮藏9 d内，对照组鱼块的菌落总数几乎保持不变，而ClO2处理组则上升较快；贮藏9～21 d期间，ClO2处理组鱼块的菌落总数始终低于对照组0.7～1.0 （lg（CFU/g））；贮藏21 d后，对照组鱼块的菌落总数继续缓慢增加，而ClO2处理组则进入平台期；贮藏27 d时，对照组鱼块的菌落总数接近107 CFU/g，且出现异味，而ClO2处理组鱼块的菌落总数直到贮藏第33天仍低于106 CFU/g。大多数研究证明了ClO2处理的减菌作用及其在保持鲜度、延长货架期方面的积极作用，但减菌程度及货架期延长程度不一。Alonso-Hernando等[19]比较了磷酸三钠（12%）、酸化次氯酸钠（1 200 μg/mL）、柠檬酸（2%）、过氧乙酸（220 μg/mL）和ClO2（50 μg/mL）的减菌效果，发现肉品经上述除菌剂处理后，残余菌的生长速率也明显加快，与本研究结果相似。
2.2.2 鱼块表面菌相
由图3可知，鱼块表面的初始菌相主要由希瓦氏菌属（86.36%）和气单胞菌属（13.64%）构成。对照组鱼块贮藏12 d后，希瓦氏菌属的相对含量明显减少，而假单胞菌属和环丝菌属明显增多；假单胞菌属的相对含量快速增加，贮藏16 d后，其相对含量已接近50%，贮藏末期（28 d后）高达72%。
ClO2处理后，鱼块表面的菌相构成没有发生明显改变，提示希瓦氏菌属和气单胞菌属对ClO2的敏感性差异不大；贮藏4 d后即出现环丝菌属（3.17%），早于对照组鱼块；贮藏8 d后，ClO2处理组鱼块表面的希瓦氏菌属相对数量明显减少，取而代之的是假单胞菌属和环丝菌属；贮藏16 d后，环丝菌属进一步增多，相对含量接近50%；贮藏20 d后，希瓦氏菌属相对含量进一步降低（8.33%），假单胞菌属迅速上升至约60%，环丝菌属数量略有下降；贮藏24～32 d期间，环丝菌属相对含量从43.6%降至29.0%，假单胞菌属由54.6%回升至60.5%，希瓦氏菌属由1.82%回升至10.53%。
蓝蔚青等[20]的研究表明，冷藏銀鲳初期细菌多样性较高，随着冷藏时间的推移，菌相组成逐渐单一化，贮藏末期假单胞菌和希瓦氏菌的相对比例分别为45.71%和33.57%。冬季冷藏银鲳的优势菌为嗜冷杆菌属（21.51%）、假单胞菌属（68.81%）和环丝菌属（9.68%），而春季冷藏银鲳的优势菌为假单胞菌属（73.28%）和希瓦氏菌属（26.72%）；贮藏期间，随着假单胞菌的增殖，希瓦氏菌的生长受到明显抑制[21]。蓝蔚青等[22]又研究了气调包装冷藏银鲳优势菌的变化，发现贮藏初期菌相由嗜冷杆菌属（54.9%）、假单胞菌属（30.8%）和葡萄球属（14.3%）构成，贮藏10 d后，优势菌主要为假单胞菌属（35.0%）、希瓦氏菌属（42.1%）、环丝菌属（11.3%）和嗜冷杆菌属（11.6%）。张璟晶等[23]也发现假单胞菌属和希瓦氏菌属是冰鲜银鲳的优势腐败菌。Ge等[24]发现大黄鱼的优势腐败菌也是假单胞菌和希瓦氏菌。
图3显示了鲳鱼块贮藏过程中假单胞菌逐渐取代希瓦氏菌，从而形成优势菌群的过程，这与二者间的竞争机制有关。Zhao Aifei等[25]的研究表明，含有荧光假单胞菌群体感应因子（包括高丝氨酸内脂、自诱导物和二酮哌嗪）的培养液能够抑制波罗的海希瓦氏菌的生长及其生物膜的形成，还能够抑制其生成三甲胺和生物胺。 2.2.3 TVB-N含量
根据水产行业标准SC/T 3103—2010《鲜、冻鲳鱼》，鲜、冻鲳鱼TVB-N含量≤18 mg/100 g属于一级鲜度，18 mg/100 g≤TVB-N含量≤30 mg/100 g为二级鲜度，即合格品。由图4可知：微冻贮藏0～4 d期间，2 组鱼肉的TVB-N含量几乎没有变化，之后开始缓慢增加；对照组鱼肉的TVB-N含量增加速率明显比ClO2处理组快，在贮藏第20天时超过一级鲜度限量值，而ClO2处理组贮藏28 d时仍然处于一级鲜度。
TVB-N主要由微生物及鱼肉内源性蛋白酶分解蛋白质、脱氨基及脱羧基作用生成。ClO2的减菌作用减少了产酶微生物总量，因此ClO2处理组鱼肉的TVB-N生成速率明显低于对照组，从而延长了鲳鱼塊处于一级鲜度的时间。另外，ClO2还可通过使蛋白质失活达到杀菌目的，因此ClO2也会造成蛋白酶失活，这也有利于降低TVB-N的生成速率[26]。
2.2.4 pH值
由图5可知：鲳鱼肉初始pH值为6.68，经ClO2处理后，鱼肉pH值降低了0.52；对照组和ClO2处理组鱼肉的pH值分别于贮藏4、8 d后降至最低点，然后开始缓慢上升，考察期终点的pH值分别为6.84和6.66。贮藏初期鱼肉pH值的下降与糖原酵解产生乳酸、ATP降解产生磷酸基有关；pH值下降后又开始缓慢上升则是鱼肉内源性及微生物来源蛋白酶降解氨基酸产生胺类等碱性物质所致。蓝蔚青等[21]的研究表明，银鲳初始pH值为7.2，冬季和春季冷藏4 d后的pH值分别升至7.6和8.2。Feng等[27]研究金鲳冷藏过程中的品质变化，发现金鲳初始pH值仅为5.92，贮藏17 d后pH值高达7.92。在本研究中，鲳鱼肉贮藏约1 个月后的pH值变化不大，推测是由于微冻贮藏降低了鱼肉内源性和微生物来源蛋白酶的活性，从而降低了脱氨及脱羧作用生成碱性物质的速率。
2.2.5 K值
由图6可知，鱼肉贮藏4～8 d内K值快速上升，之后上升速率变缓，贮藏20 d后又出现较快速增加的趋势。总体来说，2 组鱼肉K值差异不大，但处理组的K值上升速率略低于对照组，对照组和ClO2处理组鱼肉的K值分别于贮藏12、16 d达到40%。
与TVB-N含量不同的是，K值在贮藏初期更能准确评价鱼肉的鲜度。鱼死亡后，ATP在2～6 h内快速消耗分解，产生以IMP为主的风味物质，IMP继而降解为HxR和Hx，造成鱼肉鲜度降低。一般来讲，新鲜鱼的
K值≤20%，K值在20%～40%之间为二级鲜度，K值大于70%为不新鲜，进入腐败初期。但对于不同的鱼种，用来判断新鲜度的K值范围有所差异[28]。与冷藏、冰温等贮藏方式相比，微冻贮藏更有利于延缓K值的上升，从而维持水产品鲜度[29]。Manju等[30]对黑鲳鱼进行减菌处理后，发现鱼肉K值的上升速率明显减小。
2.2.6 储能模量
对比2 组鱼肉肌原纤维的温度扫描曲线，得到微冻贮藏期间鲳鱼肌原纤维蛋白在热凝过程中G’峰值的变化。由表1可知，随着贮藏时间的延长，2 组鱼肉的G’峰值均逐渐下降，表明微冻贮藏期间肌原纤维发生冷冻变性，凝胶形成能力下降。在不同贮藏时间，ClO2处理组鱼肉的G’峰值均高于对照组，而ClO2理论上并不能降低微冻造成的肌原纤维分子结构改变等影响，这提示ClO2很可能是通过减少腐败微生物及其产生的蛋白酶来减缓肌原纤维的降解程度，从而提高了肌原纤维的凝胶形成能力。
3 结 论
ClO2前处理降低了鲳鱼块贮藏前的菌落总数，从而延迟了贮藏过程中鱼块TVB-N含量、pH值、K值的上升，还能够延缓肌原纤维蛋白凝胶形成能力的下降，有利于保持鲳鱼鲜度，并延长其货架期。但是ClO2处理后鱼肉菌相没有明显改变且残余菌生长速率加快这一现象有待深入研究。
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关键词：鲳鱼；微冻贮藏；ClO2前处理
Abstract： In this paper， pomfret fillet was pretreated with ClO2 and subsequently stored at superchilled temperature （?3 ℃）. During storage， meat quality was evaluated by total plate count （TPC）， microflora， total volatile basic nitrogen （TVB-N） content， K value， pH value and rheological property （storage modulus） of myofibrillar protein. Results showed that treatment with
30 μg/mL ClO2 （1：20 of solid-to-liquid ratio （m/V）， soaking for 10 min） reduced the initial TPC by 2 （lg（CFU/g））. The ClO2 group demonstrated lower TPC than the control throughout the storage period. But during the initial stage， the growth rate of residual bacteria in the ClO2 group was higher than that of the control group. For both groups， the dominant spoilage bacteria were Shewanella and Pseudomonas at the initial and final stages， respectively. According to the TVB-N content， the freshness of the control decreased to second grade after 20 days of storage， whereas that of the ClO2 group remained the same （first grade） throughout the 32-day storage period. ClO2 treatment lowered the pH of fresh fillet by 0.52 and the pH value of the ClO2 group was always 0.2–0.4 lower than that of the control. The K values of the control and ClO2 groups reached 40% on days 12 and 16， respectively， with no significant difference being observed between the two groups during storage. The peak value of storage modulus of myofibrillar protein in the ClO2 group was higher than that of the control during the whole storage period. The above results suggested that the use of ClO2 pretreatment in conjunction with superchilled storage could maintain the freshness and extend the shelf-life of pomfret fillet.
Keywords： pomfret； superchilled storage； chlorine dioxide pretreatment
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802008
中圖分类号：TS254.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）02-0046-06
引文格式：
季晓彤， 年益莹， 薛鹏， 等. 二氧化氯对鲳鱼微冻贮藏品质的影响[J]. 肉类研究， 2018， 32（2）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802008. http：//www.rlyj.pub JI Xiaotong， NIAN Yiying， XUE Peng， et al. Effect of chlorine dioxide on pomfret quality during superchilled storage[J]. Meat Research， 2018， 32（2）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802008. http：//www.rlyj.pub
鲳鱼是我国的主要经济鱼种，2017年中国渔业统计年鉴统计数据表明，我国2016年海洋捕捞鲳鱼总产量达34.6 万t，位居海水捕捞鱼总产量的第9位。鲳鱼不但捕捞量高，而且其养殖技术也获得了突破，近年来我国金鲳的养殖量逐年增长，主要分布在福建、广东、广西、海南等东南沿海地区。鲳鱼肉质细嫩、味道鲜美、无肌间刺，是加工鱼块的优良材料。然而鱼块加工过程破坏了完整的鱼肉组织，将鱼体表和外源性腐败微生物及病原菌引入肉中，极易引起鱼肉的快速腐败变质。
二氧化氯（ClO2）作为世界卫生组织和美国农业部认定的A1级安全、高效的灭菌剂，在国内外得到广泛应用，已经从饮用水消毒、城市污水处理、医疗用品消毒、水产及畜禽疾病防治等领域扩展到食品加工及保鲜领域。水产品由于营养丰富、水分含量高、组织松弛，极易被腐败微生物侵染，导致变质腐败，因此，腐败菌数量和种类的控制一直是水产食品贮藏品质控制的核心目标。ClO2的消毒杀菌作用早已在贝类净化[1-4]、整鱼[5-7]、鱼片[8]、鱼丸[9]、鱼籽[10]、对虾[11-13]、虾肉[14]及其制品[15]
贮藏前的减菌处理方面有较多尝试和应用。Jeongmok等[16]
的研究表明，经ClO2处理后，食品的营养几乎没有改变。因此ClO2可以广泛用于食品的直接处理，我国也在GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中明确规定了ClO2可以作为防腐剂在果蔬保鲜和鱼类加工中使用。
微冻贮藏（又叫部分冻结、过冷却）是一种将水产品温度降低至初始冻结点以下1～2 ℃的轻度冷冻贮藏方法[17]。与4 ℃冷藏相比，微冻贮藏能将产品货架期延长约1.5 倍，与-18 ℃冷冻贮藏相比，微冻贮藏能够减少冷冻造成的汁液流失等问题[18]。
本研究以金鲳鱼块为研究对象，利用ClO2对其进行减菌处理，考察ClO2前处理对鲳鱼块微冻贮藏品质的影响，为鲳鱼块的贮藏保鲜及品质控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冰鲜金鲳（Trachinotus ovatus），体质量（1.0±0.1） kg，
购于大连湾海鲜市场。
ClO2 天津百多春科技有限公司；TTC培养基
青岛海博生物技术有限公司；钙及钙镁-ATP酶测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；Tris、马来酸（maleate）（均为分析纯）、K值测定相关标准品（三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP，纯度98%）、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx，纯度99%）、肌苷（inosine，HxR，纯度99%）） 生工生物工程（上海）股份有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（纯度99%） 美国Sigma公司；二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP，纯度95%）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP，纯度99%）、肌苷酸（inosine monophosphate acid，IMP，纯度99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DHR-1流变仪 美国TA仪器公司；LC-20AD液相色谱仪 日本岛津公司；Autoflex基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）仪 美国Bruker公司；DPR-9162生化培养箱
上海森信实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 原料预处理及ClO2前处理条件的优化
将冰鲜金鲳快速运送至实验室，用自来水洗净表面污物，取背部肌肉，切块，每块约200 g。
配制质量浓度分别为0、10、20、30、40 μg/mL的ClO2溶液，置于4 ℃层析柜中预冷30 min。将鲳鱼块分别置于上述不同质量浓度的ClO2溶液中浸泡10 min，料液比为1∶20（m/V），再用4 ℃无菌去离子水淋洗。对照组鱼块经4 ℃无菌去离子水浸泡、淋洗。测定鱼块的菌落总数，考察不同质量浓度ClO2溶液的减菌效果。
1.3.2 鲳鱼块的微冻贮藏
用1.3.1节确定的较适质量浓度的ClO2溶液对鲳鱼块进行浸泡处理，料液比为1∶20（m/V），浸泡时间为10 min。将鱼块取出后用灭菌的冷去离子水冲洗，洗去残留在鱼块表面的ClO2；对照组鱼块用冷自来水浸泡、淋洗。将鱼块分装于自封袋中，-3 ℃贮藏，于不同时间取样，检测鱼肉的菌落总数、菌相变化、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、pH值、K值及肌原纤维的储能模量（G’）。
1.3.3 微冻贮藏鲳鱼块的指标测定
1.3.3.1 菌落总数
参照GB/T 4789.2—2010《食品安全国家標准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的平板计数法。
1.3.3.2 可培养菌相变化
无菌制备TTC培养基，平板凝固后待用。取鱼肉进行均质，选择适宜的鱼肉均质梯度稀释液涂布于TTC平板上，30 ℃培养48 h；选择菌落总数在50 CFU/g 左右的平板，用无菌竹签挑取单菌落，均匀涂在
MALDI-TOF涂层靶板上；室温自然干燥后，再涂上1 μL基质（10 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸）；室温晾干后，用MALDI-TOF-MS仪进行鉴定，并采用质量分析器对结果进行分析，选择综合评分在2 分以上的鉴定结果。
1.3.3.3 TVB-N含量
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的第三法微量扩散法。
1.3.3.4 pH值
参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》。
1.3.3.5 K值
K值被定义为HxR和Hx的总量之和与ATP及其分解物总量之比的百分率。K值按照下式计算。
根据SC/T 3048—2014《鱼类鲜度指标K值的测定 高效液相色谱法》进行样品处理，采用高效液相色谱法测定鲳鱼肌肉K值。测定条件：COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）[10]；洗脱液为pH 6.0的0.02 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液（KH2PO4与K2HPO4的体积比为1∶1）；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 mL；检测波长254 nm。
1.3.3.6 肌原纤维储能模量
用Tris-maleate（含0.4 mol/L KCl，pH 7）缓冲液将肌原纤维蛋白质量浓度调至20 mg/mL，上样量2 mL，均匀涂抹在上样板上，设定上下板之间的距离为1 mm，温度应变1%，测试频率0.2 Hz，程序升温到20 ℃，之后每隔1 min温度升高1 ℃，记录测试温度为20～80 ℃的数据并分析。
2 结果与分析
2.1 ClO2前处理条件的优化结果
由图1可知，ClO2质量浓度达到30 μg/mL时，鱼块的菌落总数明显下降，当ClO2质量浓度升至40 μg/mL时，减菌效果没有明显增强，因此选择30 μg/mL作为后续鲳鱼块减菌处理的ClO2使用质量浓度。根据食品添加剂使用标准GB 2760—2014的规定，稳定态ClO2可用于水产品及其制品（仅限鱼类加工）中，最大使用量为
0.05 g/kg，即50 μg/mL。因此，30 μg/mL的使用质量浓度符合国家标准要求。
2.2 微冻贮藏鲳鱼块贮藏期间的指标变化
2.2.1 菌落总数
由图2可知：经30 μg/mL的ClO2处理后，鱼块初始菌落总数降低了近2 （lg（CFU/g））；贮藏9 d内，对照组鱼块的菌落总数几乎保持不变，而ClO2处理组则上升较快；贮藏9～21 d期间，ClO2处理组鱼块的菌落总数始终低于对照组0.7～1.0 （lg（CFU/g））；贮藏21 d后，对照组鱼块的菌落总数继续缓慢增加，而ClO2处理组则进入平台期；贮藏27 d时，对照组鱼块的菌落总数接近107 CFU/g，且出现异味，而ClO2处理组鱼块的菌落总数直到贮藏第33天仍低于106 CFU/g。大多数研究证明了ClO2处理的减菌作用及其在保持鲜度、延长货架期方面的积极作用，但减菌程度及货架期延长程度不一。Alonso-Hernando等[19]比较了磷酸三钠（12%）、酸化次氯酸钠（1 200 μg/mL）、柠檬酸（2%）、过氧乙酸（220 μg/mL）和ClO2（50 μg/mL）的减菌效果，发现肉品经上述除菌剂处理后，残余菌的生长速率也明显加快，与本研究结果相似。
2.2.2 鱼块表面菌相
由图3可知，鱼块表面的初始菌相主要由希瓦氏菌属（86.36%）和气单胞菌属（13.64%）构成。对照组鱼块贮藏12 d后，希瓦氏菌属的相对含量明显减少，而假单胞菌属和环丝菌属明显增多；假单胞菌属的相对含量快速增加，贮藏16 d后，其相对含量已接近50%，贮藏末期（28 d后）高达72%。
ClO2处理后，鱼块表面的菌相构成没有发生明显改变，提示希瓦氏菌属和气单胞菌属对ClO2的敏感性差异不大；贮藏4 d后即出现环丝菌属（3.17%），早于对照组鱼块；贮藏8 d后，ClO2处理组鱼块表面的希瓦氏菌属相对数量明显减少，取而代之的是假单胞菌属和环丝菌属；贮藏16 d后，环丝菌属进一步增多，相对含量接近50%；贮藏20 d后，希瓦氏菌属相对含量进一步降低（8.33%），假单胞菌属迅速上升至约60%，环丝菌属数量略有下降；贮藏24～32 d期间，环丝菌属相对含量从43.6%降至29.0%，假单胞菌属由54.6%回升至60.5%，希瓦氏菌属由1.82%回升至10.53%。
蓝蔚青等[20]的研究表明，冷藏銀鲳初期细菌多样性较高，随着冷藏时间的推移，菌相组成逐渐单一化，贮藏末期假单胞菌和希瓦氏菌的相对比例分别为45.71%和33.57%。冬季冷藏银鲳的优势菌为嗜冷杆菌属（21.51%）、假单胞菌属（68.81%）和环丝菌属（9.68%），而春季冷藏银鲳的优势菌为假单胞菌属（73.28%）和希瓦氏菌属（26.72%）；贮藏期间，随着假单胞菌的增殖，希瓦氏菌的生长受到明显抑制[21]。蓝蔚青等[22]又研究了气调包装冷藏银鲳优势菌的变化，发现贮藏初期菌相由嗜冷杆菌属（54.9%）、假单胞菌属（30.8%）和葡萄球属（14.3%）构成，贮藏10 d后，优势菌主要为假单胞菌属（35.0%）、希瓦氏菌属（42.1%）、环丝菌属（11.3%）和嗜冷杆菌属（11.6%）。张璟晶等[23]也发现假单胞菌属和希瓦氏菌属是冰鲜银鲳的优势腐败菌。Ge等[24]发现大黄鱼的优势腐败菌也是假单胞菌和希瓦氏菌。
图3显示了鲳鱼块贮藏过程中假单胞菌逐渐取代希瓦氏菌，从而形成优势菌群的过程，这与二者间的竞争机制有关。Zhao Aifei等[25]的研究表明，含有荧光假单胞菌群体感应因子（包括高丝氨酸内脂、自诱导物和二酮哌嗪）的培养液能够抑制波罗的海希瓦氏菌的生长及其生物膜的形成，还能够抑制其生成三甲胺和生物胺。 2.2.3 TVB-N含量
根据水产行业标准SC/T 3103—2010《鲜、冻鲳鱼》，鲜、冻鲳鱼TVB-N含量≤18 mg/100 g属于一级鲜度，18 mg/100 g≤TVB-N含量≤30 mg/100 g为二级鲜度，即合格品。由图4可知：微冻贮藏0～4 d期间，2 组鱼肉的TVB-N含量几乎没有变化，之后开始缓慢增加；对照组鱼肉的TVB-N含量增加速率明显比ClO2处理组快，在贮藏第20天时超过一级鲜度限量值，而ClO2处理组贮藏28 d时仍然处于一级鲜度。
TVB-N主要由微生物及鱼肉内源性蛋白酶分解蛋白质、脱氨基及脱羧基作用生成。ClO2的减菌作用减少了产酶微生物总量，因此ClO2处理组鱼肉的TVB-N生成速率明显低于对照组，从而延长了鲳鱼塊处于一级鲜度的时间。另外，ClO2还可通过使蛋白质失活达到杀菌目的，因此ClO2也会造成蛋白酶失活，这也有利于降低TVB-N的生成速率[26]。
2.2.4 pH值
由图5可知：鲳鱼肉初始pH值为6.68，经ClO2处理后，鱼肉pH值降低了0.52；对照组和ClO2处理组鱼肉的pH值分别于贮藏4、8 d后降至最低点，然后开始缓慢上升，考察期终点的pH值分别为6.84和6.66。贮藏初期鱼肉pH值的下降与糖原酵解产生乳酸、ATP降解产生磷酸基有关；pH值下降后又开始缓慢上升则是鱼肉内源性及微生物来源蛋白酶降解氨基酸产生胺类等碱性物质所致。蓝蔚青等[21]的研究表明，银鲳初始pH值为7.2，冬季和春季冷藏4 d后的pH值分别升至7.6和8.2。Feng等[27]研究金鲳冷藏过程中的品质变化，发现金鲳初始pH值仅为5.92，贮藏17 d后pH值高达7.92。在本研究中，鲳鱼肉贮藏约1 个月后的pH值变化不大，推测是由于微冻贮藏降低了鱼肉内源性和微生物来源蛋白酶的活性，从而降低了脱氨及脱羧作用生成碱性物质的速率。
2.2.5 K值
由图6可知，鱼肉贮藏4～8 d内K值快速上升，之后上升速率变缓，贮藏20 d后又出现较快速增加的趋势。总体来说，2 组鱼肉K值差异不大，但处理组的K值上升速率略低于对照组，对照组和ClO2处理组鱼肉的K值分别于贮藏12、16 d达到40%。
与TVB-N含量不同的是，K值在贮藏初期更能准确评价鱼肉的鲜度。鱼死亡后，ATP在2～6 h内快速消耗分解，产生以IMP为主的风味物质，IMP继而降解为HxR和Hx，造成鱼肉鲜度降低。一般来讲，新鲜鱼的
K值≤20%，K值在20%～40%之间为二级鲜度，K值大于70%为不新鲜，进入腐败初期。但对于不同的鱼种，用来判断新鲜度的K值范围有所差异[28]。与冷藏、冰温等贮藏方式相比，微冻贮藏更有利于延缓K值的上升，从而维持水产品鲜度[29]。Manju等[30]对黑鲳鱼进行减菌处理后，发现鱼肉K值的上升速率明显减小。
2.2.6 储能模量
对比2 组鱼肉肌原纤维的温度扫描曲线，得到微冻贮藏期间鲳鱼肌原纤维蛋白在热凝过程中G’峰值的变化。由表1可知，随着贮藏时间的延长，2 组鱼肉的G’峰值均逐渐下降，表明微冻贮藏期间肌原纤维发生冷冻变性，凝胶形成能力下降。在不同贮藏时间，ClO2处理组鱼肉的G’峰值均高于对照组，而ClO2理论上并不能降低微冻造成的肌原纤维分子结构改变等影响，这提示ClO2很可能是通过减少腐败微生物及其产生的蛋白酶来减缓肌原纤维的降解程度，从而提高了肌原纤维的凝胶形成能力。
3 结 论
ClO2前处理降低了鲳鱼块贮藏前的菌落总数，从而延迟了贮藏过程中鱼块TVB-N含量、pH值、K值的上升，还能够延缓肌原纤维蛋白凝胶形成能力的下降，有利于保持鲳鱼鲜度，并延长其货架期。但是ClO2处理后鱼肉菌相没有明显改变且残余菌生长速率加快这一现象有待深入研究。
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