论文部分内容阅读
摘 要：尝试前处理采用超声波一步提取淡水鱼氯霉素药物残留并液相串联质谱仪检测的方法，相比于GB/T 20756-2006《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》前处理步骤相对简单、快速，采用内标法定量，选用鲢鱼为空白，添加0.1 μg/kg、0.3 μg/kg，回收率在 90%～120%，在0.1～2.0 ng/mL范围内线性关系良好，R2>0.999，相对标准偏差（RSD）<9%，满足GB/T 20756-2006和GB/T 27404-2008对准确度和精密度的要求。通过计算得到理论方法检出限（LOD）为0002 μg/kg，理论方法定量限（LOQ）为0.008 μg/kg。
关键词：超声波；氯霉素检测；初探
氯霉素是一种广谱抗生素，因其效高价廉，曾在水产养殖中广范应用。但氯霉素具有较强的毒副作用，带来了水产品种氯霉素残留的严重问题。氯霉素残留可通过食物链传给人类，对人类的健康造成巨大威胁[1]。目前检测水产品种氯霉素的方法有很多种，其中液相串联质谱法以其前处理简单、分析快速准确脱颖而出。本实验室采用《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》进行水产品氯霉素药物残留的检测方法。本文在GB/T 20756-2006的基础上尝试将超声波一步提取应用到前处理当中，在保证了检测方法灵敏度、准确度和精密度完全符合要求的基础上，使整个实验进行更加简单快速。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
氯霉素标准品德国Dr.E，纯度≥98.5% Lot No.90424，氘代氯霉素标准品德国Dr.E 100 μg/mL[1]。乙酸乙酯，Fisher，色谱纯；正己烷，沃凯，色谱纯；屈臣氏蒸馏水。
1.2 主要仪器
IKA分析研磨机；数控超声波清洗器KQ-500DE型； 湘仪离心机TDAA-WS； EYELA旋转蒸发仪；日立高速冷冻离心机 HITACHI CF16RXⅡ[1]；液相串联质谱仪Wters TQ-S；色谱柱 waters C18柱：50 mm×2.1 mm，1.7 μm。
1.3 试验部分
1.3.1 标准溶液配制 按照GB/T 20756-2006操作[2]。
1.3.2 样品前处理 称取5 g淡水鱼肉糜样品（IKA分析研磨机磨），精确至0.01 g。于50 mL具塞离心管中，加入75μL 氘代氯霉素使用液（20 ng/mL）、15 mL乙酸乙酯，上下振摇混匀1 min，放到数控超声波清洗器中，超声频率40 KHz，超声功率100%（500 W），超声15 min，再上下振摇混匀1 min，4 000 r/min离心10 min，取出上清，注意不要吸到水相， 45 ℃旋转蒸发至干，5～10 mL正己烷涡旋混匀除脂，3 mL屈臣氏蒸馏水溶解，涡旋混匀，静止分层，取下层水相到1.5 mL塑料离心管12 000 r/min 4 ℃冷冻离心，0.22 μm水相滤膜过滤，得到样品用于Waters TQ-S液相串联质谱仪器测定[3]。
1.3.3 液质联用仪分析条件
1.3.3.1 色谱条件 50 mm×2.1 mm，1.7 μm C18柱；柱温40 ℃；流速0.2 mL/ min；流动相为A屈臣氏蒸馏水和B乙腈，采用梯度洗脱：0～2 min，A：B为70%：30%；2 min，A：B为30%：70% ；3 min，A：B为5%：95；4 min，A：B为70%：30%。
1.3.3.2 质谱条件 质谱分析条件见表1，氯霉素及氘代氯霉素的多反应监测谱图见图1、图2。
1.4 检测方法灵敏度、准确度和精密度
配制0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ng/mL 6个不同质量浓度的氯霉素标准溶液，氘代氯霉素的质量浓度为0.5 ng/mL，以质量浓度为横坐标，峰面积的比值（氯霉素峰面积/氘代氯霉素-D5面积）为纵坐标，绘制标准曲线。选取阴性鲢鱼肉糜样品，添加氯霉素标准品和内标，氯霉素标准品添加水平为0.1 μg/kg、0.3 μg/kg，氘代氯霉素 0.3 μg/kg，每个添加水平3次平行。以公式3C/（S/N）计算理论方法检出限（LOD），以公式10C/（S/N）计算理论方法检量限（LOQ）[1]。
2 试验结果
2.1 检测方法灵敏度
数据显示CAP在0.1～2.0 ng/mL范围内线性关系良好，R2>0.999。根据添加量为0.3 μg/kg的3个样品152定量离子的最低信噪比和计算公式3C/（S/N），计算理论方法检出限（LOD）为0.002 μg/kg，理论方法定量限为（LOQ）为0.008 μg/kg。
2.2 准确度和精密度
添加量为0.1 μg/kg时回收率为102%～120%，RSD<9% ；添加量为0.3 μg/kg时回收率为90%～104%，RSD<6% 。
2.3 实际样品的检测
利用该方法对170个淡水鱼样品（鲤鱼、鲫鱼、虹鳟、黄颡鱼、鲢鱼）进行检测，检出两个阳性样品，其中一个为超标样品。
3 讨论
3.1 超声波一步提取的初探
超声波提取在检测中应用广泛，在石油烃的提取和药物残留的提取中起到增大提取效率提高回收率的效果[4-8]。在采用GB/T 20756-2006进行检测的过程中，前处理步骤较繁琐（超声波提取是其中一步），无水硫酸钠会使提取液盐度升高从而影响液质联用仪的正常运行，而且极有可能引入其他污染物质而影响检测结果，另外匀质器极有可能引起交叉污染。目前我们在样品处理时已经把鱼肉打成肉糜，因此大胆尝试了超声波提取代匀质器一步提取氯霉素的方法，此方法使前处理变得简单又快速。 3.2 检测方法灵敏度、准确度和精密度
经过计算，超声波一步提取淡水鱼中氯霉素残留的理论方法检出限（LOD）为0.002 μg/kg，理论方法定量限为（LOQ）为0.008 μg/kg。添加量为0.1 μg/kg时回收率为102%～120%，RSD<9%；添加量为0.3 μg/kg时回收率为90%～104%，RSD<6% 。所有数据都满足GB/T 20756-2006[2]以及GB/T 27404-2008[9]对准确度和精密度的所有要求。
4 结语
本文总结了在检测淡水鱼氯霉素药物残留中采用超声波一步提取的初步尝试，实验以淡水鱼（鲢鱼）为例做灵敏度、准确度和精密度计算，满足GB/T 20756-2006[2]以及GB/T 27404-2008[9]对回收率和精密度的所有要求。但仅仅用淡水鱼是不够的，还需要扩大应用范围，作者还会继续尝试在河蟹、海参、海水养殖鱼（大菱鲆）等水产品种类的应用。
参考文献：
[1] 罗靳.鱼配合饲料中氯霉素残留量的检测方法[J].河北渔业，2015（9）：43-45，73
[2] GB/T 20756-2006.可食性动物肌肉、肝脏、和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法[S].北京：中国标准出版社，2007
[3] 薄尔琳，郑怀东，刘学光.同位素稀释液相色谱-串联质谱法快速测定海参中氯霉素[J].中国渔业质量与标准，2013，3（4）：36—41
[4] 任松，陈卫卫，卜建平，等.超声波提取在近海沉积物油类测定中的应用[J].海洋环境科学，2005，24（1）：35-37
[5] 郭伟，张春晖，臧勇军.LC-APCI-MS同时检测猪肉中7种磺胺类药物残留[J].食品研究与开发，2006，27（10）：120-123
[6] 于维森，于红卫，郝文等.液相色谱-串联质谱法测定常见食品中磺胺及喹诺酮[J].预防兽医学论坛，2011，17（2）：102-105
[7] 罗晓燕，林玉娜，刘莉治.SPE-HPLC法同时测定水产品中四种抗生素残留的研究[J].现代预防医学，2005，32（3）：198-220
[8] 罗晓燕，林玉娜，刘莉治.高效液相色谱法同时测定动物组织中四种抗生素残留量的研究[J].中国卫生检验杂志，2004，14（4）：443-444
[9] GB/T 27404-2008.实验室质量控制规范 食品理化检测[S].北京：中国标准出版社，2008
（收稿日期：2016-05-31）
关键词：超声波；氯霉素检测；初探
氯霉素是一种广谱抗生素，因其效高价廉，曾在水产养殖中广范应用。但氯霉素具有较强的毒副作用，带来了水产品种氯霉素残留的严重问题。氯霉素残留可通过食物链传给人类，对人类的健康造成巨大威胁[1]。目前检测水产品种氯霉素的方法有很多种，其中液相串联质谱法以其前处理简单、分析快速准确脱颖而出。本实验室采用《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》进行水产品氯霉素药物残留的检测方法。本文在GB/T 20756-2006的基础上尝试将超声波一步提取应用到前处理当中，在保证了检测方法灵敏度、准确度和精密度完全符合要求的基础上，使整个实验进行更加简单快速。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
氯霉素标准品德国Dr.E，纯度≥98.5% Lot No.90424，氘代氯霉素标准品德国Dr.E 100 μg/mL[1]。乙酸乙酯，Fisher，色谱纯；正己烷，沃凯，色谱纯；屈臣氏蒸馏水。
1.2 主要仪器
IKA分析研磨机；数控超声波清洗器KQ-500DE型； 湘仪离心机TDAA-WS； EYELA旋转蒸发仪；日立高速冷冻离心机 HITACHI CF16RXⅡ[1]；液相串联质谱仪Wters TQ-S；色谱柱 waters C18柱：50 mm×2.1 mm，1.7 μm。
1.3 试验部分
1.3.1 标准溶液配制 按照GB/T 20756-2006操作[2]。
1.3.2 样品前处理 称取5 g淡水鱼肉糜样品（IKA分析研磨机磨），精确至0.01 g。于50 mL具塞离心管中，加入75μL 氘代氯霉素使用液（20 ng/mL）、15 mL乙酸乙酯，上下振摇混匀1 min，放到数控超声波清洗器中，超声频率40 KHz，超声功率100%（500 W），超声15 min，再上下振摇混匀1 min，4 000 r/min离心10 min，取出上清，注意不要吸到水相， 45 ℃旋转蒸发至干，5～10 mL正己烷涡旋混匀除脂，3 mL屈臣氏蒸馏水溶解，涡旋混匀，静止分层，取下层水相到1.5 mL塑料离心管12 000 r/min 4 ℃冷冻离心，0.22 μm水相滤膜过滤，得到样品用于Waters TQ-S液相串联质谱仪器测定[3]。
1.3.3 液质联用仪分析条件
1.3.3.1 色谱条件 50 mm×2.1 mm，1.7 μm C18柱；柱温40 ℃；流速0.2 mL/ min；流动相为A屈臣氏蒸馏水和B乙腈，采用梯度洗脱：0～2 min，A：B为70%：30%；2 min，A：B为30%：70% ；3 min，A：B为5%：95；4 min，A：B为70%：30%。
1.3.3.2 质谱条件 质谱分析条件见表1，氯霉素及氘代氯霉素的多反应监测谱图见图1、图2。
1.4 检测方法灵敏度、准确度和精密度
配制0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ng/mL 6个不同质量浓度的氯霉素标准溶液，氘代氯霉素的质量浓度为0.5 ng/mL，以质量浓度为横坐标，峰面积的比值（氯霉素峰面积/氘代氯霉素-D5面积）为纵坐标，绘制标准曲线。选取阴性鲢鱼肉糜样品，添加氯霉素标准品和内标，氯霉素标准品添加水平为0.1 μg/kg、0.3 μg/kg，氘代氯霉素 0.3 μg/kg，每个添加水平3次平行。以公式3C/（S/N）计算理论方法检出限（LOD），以公式10C/（S/N）计算理论方法检量限（LOQ）[1]。
2 试验结果
2.1 检测方法灵敏度
数据显示CAP在0.1～2.0 ng/mL范围内线性关系良好，R2>0.999。根据添加量为0.3 μg/kg的3个样品152定量离子的最低信噪比和计算公式3C/（S/N），计算理论方法检出限（LOD）为0.002 μg/kg，理论方法定量限为（LOQ）为0.008 μg/kg。
2.2 准确度和精密度
添加量为0.1 μg/kg时回收率为102%～120%，RSD<9% ；添加量为0.3 μg/kg时回收率为90%～104%，RSD<6% 。
2.3 实际样品的检测
利用该方法对170个淡水鱼样品（鲤鱼、鲫鱼、虹鳟、黄颡鱼、鲢鱼）进行检测，检出两个阳性样品，其中一个为超标样品。
3 讨论
3.1 超声波一步提取的初探
超声波提取在检测中应用广泛，在石油烃的提取和药物残留的提取中起到增大提取效率提高回收率的效果[4-8]。在采用GB/T 20756-2006进行检测的过程中，前处理步骤较繁琐（超声波提取是其中一步），无水硫酸钠会使提取液盐度升高从而影响液质联用仪的正常运行，而且极有可能引入其他污染物质而影响检测结果，另外匀质器极有可能引起交叉污染。目前我们在样品处理时已经把鱼肉打成肉糜，因此大胆尝试了超声波提取代匀质器一步提取氯霉素的方法，此方法使前处理变得简单又快速。 3.2 检测方法灵敏度、准确度和精密度
经过计算，超声波一步提取淡水鱼中氯霉素残留的理论方法检出限（LOD）为0.002 μg/kg，理论方法定量限为（LOQ）为0.008 μg/kg。添加量为0.1 μg/kg时回收率为102%～120%，RSD<9%；添加量为0.3 μg/kg时回收率为90%～104%，RSD<6% 。所有数据都满足GB/T 20756-2006[2]以及GB/T 27404-2008[9]对准确度和精密度的所有要求。
4 结语
本文总结了在检测淡水鱼氯霉素药物残留中采用超声波一步提取的初步尝试，实验以淡水鱼（鲢鱼）为例做灵敏度、准确度和精密度计算，满足GB/T 20756-2006[2]以及GB/T 27404-2008[9]对回收率和精密度的所有要求。但仅仅用淡水鱼是不够的，还需要扩大应用范围，作者还会继续尝试在河蟹、海参、海水养殖鱼（大菱鲆）等水产品种类的应用。
参考文献：
[1] 罗靳.鱼配合饲料中氯霉素残留量的检测方法[J].河北渔业，2015（9）：43-45，73
[2] GB/T 20756-2006.可食性动物肌肉、肝脏、和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法[S].北京：中国标准出版社，2007
[3] 薄尔琳，郑怀东，刘学光.同位素稀释液相色谱-串联质谱法快速测定海参中氯霉素[J].中国渔业质量与标准，2013，3（4）：36—41
[4] 任松，陈卫卫，卜建平，等.超声波提取在近海沉积物油类测定中的应用[J].海洋环境科学，2005，24（1）：35-37
[5] 郭伟，张春晖，臧勇军.LC-APCI-MS同时检测猪肉中7种磺胺类药物残留[J].食品研究与开发，2006，27（10）：120-123
[6] 于维森，于红卫，郝文等.液相色谱-串联质谱法测定常见食品中磺胺及喹诺酮[J].预防兽医学论坛，2011，17（2）：102-105
[7] 罗晓燕，林玉娜，刘莉治.SPE-HPLC法同时测定水产品中四种抗生素残留的研究[J].现代预防医学，2005，32（3）：198-220
[8] 罗晓燕，林玉娜，刘莉治.高效液相色谱法同时测定动物组织中四种抗生素残留量的研究[J].中国卫生检验杂志，2004，14（4）：443-444
[9] GB/T 27404-2008.实验室质量控制规范 食品理化检测[S].北京：中国标准出版社，2008
（收稿日期：2016-05-31）