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【摘 要】 报告了类风湿关节炎造模方法的研究现状。常用的西医造模方法有佐剂诱导、胶原诱导等，常用的中医造模方法有模拟外感风寒湿、风湿热、肾虚等症状，常用的中西医结合的造模方法即将二者相结合。常用的模型评价标准主要从关节、病理、免疫、影像4个方面进行。
【关键词】 关节炎，类风湿；痹证；动物模型；造模方法；评价；综述
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.04.021
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种由慢性关节炎导致的以累及周围关节为主的自身免疫性疾病[1]。RA在国外的患病率为1%，是造成人群残疾和丧失工作能力的主要病因之一[2]；我国的患病率约为0.37%[3]。RA患者会感觉关节肿痛、僵硬、变形，肌肉无力，严重者可出现关节脱位[4-6]。国内外关于RA的动物模型的制备方法有许多种，并针对不同的研究方向选择不同的制备方法并加以改善。本文即阐述目前关于RA动物模型制备及模型评价的常用方法。
1 造模方法及评价
1.1 西医造模方法
1.1.1 佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）模型 关于AA的制备，Pottier等[7]选用结核分枝杆菌加入弗氏不完全佐剂中（incomplete freund's adjuvant，IFA），制成含5 mg·mL-1（Mtb）的油包水乳剂。在小鼠尾根部皮下注射100 μL致炎。刘健等[8]选用卡介苗，并按石蜡油与羊毛脂1∶1比例配置成完全佐剂于大鼠的右后足皮内注射
0.1 mL致炎。
AA的原理目前被接受的是分子模拟理论，结核分枝杆菌上的蛋白分子与关节滑膜上的相似，可以被同一株T细胞所识别，从而诱发抗原抗体反应，引发炎症。
AA的改进方面，彭传玉等[9]实验研究发现，注射0.15 mL弗氏完全佐剂（complete freund's adjuvant，CFA）模型最接近人类病变。改变石蜡油和羊毛脂的比例可以依实验要求配置更加理想的CFA，现常使用的配比为羊毛脂∶石蜡油1∶1，1∶2，1∶3，2∶3等。李伟等[10]选用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）于大鼠踝关节和髌骨下的脂肪垫注射加强免疫，之后发现可以在8 h左右出现部分急性炎症症状，2 d时肿胀达峰值，能够明显缩短免疫时间，提高造模效果。
评价：Pottier等[7]发现，炎症初期出现足跖趾关节、踝关节肿胀，之后发展至整个四肢，20 d左右达到高峰，之后降低。Zheng等[11]通过影像学检查发现骨的改变，骨小梁、组织矿物质含量降低，骨组织出现不可逆的病变。薛盟举[12]发现，继发病变可以出现行动不便，耳部及尾部有关节炎小结的出现，并伴有变异性角膜炎等。
1.1.2 胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型 关于CIA的制备，韩冰等[13-14]将牛源性Ⅱ型胶原细胞与IFA混合，从脊柱两旁皮下多点或从尾部注射，每只鼠注射1 mL，1周后注射0.5 mL加强免疫一次。康建功等[15]将牛源性Ⅱ型胶原细胞与等体积的CFA混合。在大鼠颈背部多点皮下注射，总量0.5 mL。21 d后注射0.3 mL加强免疫。Zimmerman等[16-17]将牛胶原蛋白与CFA按照1∶1乳化混合，在小鼠的尾根部多点注射，共注射0.1 mL，21 d后将牛胶原蛋白与IFA按照等体积混合，在尾根部或者爪部注射
0.1 mL加强免疫。
Ⅱ型胶原是人软骨基质的主要成分，1977年Trentham等[18]首次发现Ⅱ型胶原，并以此成功诱导了RA大鼠。Park等[19]认为，Ⅱ型胶原细胞使活化的B细胞产生特异性抗体，在关节部位与胶原蛋白结合形成免疫复合物，活化了补体系统导致炎症反应，使中性粒细胞、T细胞聚集至关节部位，进一步激发活化，使关节周围的滑膜组织不断增生，形成血管翳，侵袭周围的骨组织，导致广泛的骨质疏松，骨皮质变薄，同时也伴有骨质增生的现象。
评价：①关节：大鼠足关节出现红肿，活动受限，随着炎症进展，大鼠可出现皮肤溃疡或关节变形。②病理方面：滑膜细胞明显增生，层次增多，排列紊乱，并可见滑膜脂肪水肿，炎性细胞浸润及肉芽组织形成[13-15]。③免疫学改变：张敏娜[20]发现，红细胞沉降率明显升高，中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞浸润，出现高滴度的IgG抗体，破骨细胞异常增生。
常用的试剂有牛源性、鸡源性、鼠源性或者人胶原细胞。文献中多选用牛源性Ⅱ型胶原细胞。传统的CIA造模多选用牛源性Ⅱ型胶原细胞与IFA混合制作的乳化剂；近年来，多选用牛源性Ⅱ型胶原细胞与CFA混合制作的乳化剂，原因可能是大鼠对于CFA较为敏感，造模的成功率也更高。国外制作RA的动物模型多选用Lewis大鼠，国内多选用Lewis、SD或者Wistar大鼠，小鼠多选用DBA-1小鼠。张云等[21]研究各种鼠的品种比较表明，小鼠的发病时间较大鼠晚；赵宏艳等[22]发现，Lewis比SD、Wistar大鼠关节评分低，Wistar大鼠CIA组脾脏系数明显高于正常对照组，Wistar雌性CIA 组肾上腺系数较正常对照组，明显升高。Kannan等[23]将羊等大型动物作为RA的造模动物，以弥补鼠或者兔体积较小容易出现提取组织量不够的缺陷。
1.1.3 卵蛋白诱导的关节炎模型 魏东明等[24-25]将卵蛋白溶液与等体积IFA混合，在家兔皮下注射1 mL。28 d后，在关节腔内注射3%卵蛋白溶液
0.2 mL进行二次致敏。
卵蛋白诱导首次出现在1962年，姜辉等[26]认为，关节内抗原持续存在，刺激滑膜细胞出现抗体，并形成抗原-抗体-C3复合物，产生局部的炎症反应，产生大量的淋巴细胞、单核巨噬细胞及中性粒细胞浸润，产生血管翳，从而导致骨破坏。 评价：魏东明等[24-25]发现，家兔关节出现肿胀，活动度下降，关节僵硬，不能负重甚至关节变形。
1.1.4 降植烷诱导的关节炎（pristine-induced arthritis，PIA）模型 赵义等[27]在大鼠尾根部共注射降植烷150 mg，制作模型。
评价：①关节：大鼠出现关节肿胀，累及远端关节，关节炎症状呈慢性反复及进行性加重。②免疫学改变：红细胞沉降率明显升高[27]。③影像及病理：关节滑膜增生、软骨组织及骨组织呈典型的关节炎病变[28]。
Abdalmula等[29]发现，降植烷诱导的模型原本用于大鼠的模型制作，但目前已被发现可以诱导一定的小鼠RA及系统性红斑狼疮的模型。
1.1.5 其他方法 软骨低聚体基质蛋白（COMP）诱导：使用COMP与弗氏不完全佐剂混合，经尾部皮下注射。佐剂角叉菜胶诱导：使用CFA与角叉菜胶在足趾皮下注射。转基因鼠：Myers等[30]发现，HLA-DR1转基因鼠在使用胶原诱导造模时的成功率比正常小鼠的成功率高。油诱导：石磊
等[31]发现，只适用于DA大鼠，将微量的IFA注射于大鼠的皮下。甲基双十八烷基铵溴化物诱导：与磷酸缓冲液融合注射于大鼠皮下。
1.2 常用的中医造模方法 RA属中医学“痹证”范畴，主要的病理因素是外感风寒湿邪或者风湿热邪日久入侵机体。金祝秋等[32-33]通过中医的病机学说模拟病因，让大鼠在冰水或热水合并强风的条件下造模。
1.3 中西医结合造模方法 肖长虹等[33]在CIA的造模基础上从造模第1天起加入风寒湿或者风湿热的外因诱导。徐世杰等[34-35]在CIA的基础上利用去势等方法制出肾虚CIA模型。
2 对评价标准的评价
关于实验动物是否造模成功的评价标准，种类较多且较为混乱，常用的有以下4种评价标准。①关节肿胀程度及行为学改变：多采用关节炎指数评分法，此种方法较直观，但是没有统一的标准，且关于轻度肿胀、中度肿胀、重度肿胀的评价没有明确的标准，可能会对模型分级存在争议；或测量肿胀率，即测量动物致炎前后的足容积改变，但改变较小时可能会导致结果不精准。②影像学检查：X线下观察骨改变，贴近临床，但对于需要反复评价的动物，可能会因辐射而对实验结果产生影响；超声检测对检测者的要求较高，一般实验室不易实
施；MRI或者PET-CT花费较高，一般在动物实验时也不加考虑。③免疫学检查：采用血清或者关节液中鉴定红细胞沉降率、类风湿因子、中性粒细胞、淋巴细胞等指标，临床也多采用此法，或者测定白细胞介素（IL）-6、IL-1、抗Ⅱ型胶原的量的方法，但大鼠的病变组织的关节液较少，不易抽取；且大鼠的安全取血量约为1 mL左右，如果要完成多种因子的测定需处死大鼠，可能会影响实验的连贯性，而且不同的造模方法对于免疫学的改变各有偏颇，不能完全代表临床改变。④病理学改变：定期取部分大鼠处死将病变关节制成病理切片观察，此种制作方法较为复杂，且观察不具有连贯性，但是可以明确诊断，观察到滑膜、炎性细胞、胶原细胞、血管翳的形成等多种指标，也可以长期保存。
3 讨 论
比较各种造模方法发现，AA和CIA均有骨质的改变，AA的制备方法较简单，发病快，肿胀较明显，有大量的炎细胞浸润，病理学改变与临床相似，都是从关节边缘开始进行性骨破坏，但缺乏慢性病理过程，有一定的局限性。CIA造模动物的骨性改变更加明显，RA的持续时间更长，但起病相对较缓慢，没有病情的波动及反复，也没有关节外皮肤及眼部表现的改变。Ren等[36]发现，卵蛋白多用来诱导兔、羊等较大的关节，成功率高，但是免疫学指标与病程特点与临床有差别。罗辉宇等[37]发现，PIA诱导的Lewis大鼠在临床表现尤其是类风湿因子的表达方面与临床较为相似。石磊等[31]发现，油诱导和甲基双十八烷基铵溴化物诱导关节可出现红肿，但红肿程度较低，且不出现CII抗体。将传统的中医病因病机与西医的造模方法相结合是传统医学实验的进步，目前已有将风寒湿、风湿热、肾虚、脾虚等与CIA或者AA相结合的造模方法，但薛盟举[12]认为，人体是个复杂的整体，人工模拟的风、寒、湿、热病因与人体所感受的自然界的病因不完全相符，故此种方法会存在争议，且可能出现造模时间长，且成功率不高的可能性。
关节肿胀在所有造模中均有涉及，而AA的造模中常选用X线或者病理与免疫检查组合的检验方法作为评价标准，CIA中多直接采用病理和免疫结合的方法。
在药物实验时，张巍等[38]选择造模成功的动物，通过酶消化的方法提取出关节中主要导致RA的成纤维细胞体外培养，并加以试验药物，观察细胞的变化。此种方法比动物实验操作简单，但是RA是由复杂的多原因导致的自身免疫性疾病，而仅用细胞研究不能真实地模拟人体的整个内环境的变化等，故仍不能代替动物实验。
因此，要建立更加贴近临床的动物模型还需不断研究。多种评价标准联合使用是如今动物模型评价的主流方向，但建立可以连续性观察、更加规范化、更加贴近临床的评价标准仍需不断努力。
4 参考文献
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收稿日期：2014-11-27；修回日期：2015-01-12
【关键词】 关节炎，类风湿；痹证；动物模型；造模方法；评价；综述
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.04.021
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种由慢性关节炎导致的以累及周围关节为主的自身免疫性疾病[1]。RA在国外的患病率为1%，是造成人群残疾和丧失工作能力的主要病因之一[2]；我国的患病率约为0.37%[3]。RA患者会感觉关节肿痛、僵硬、变形，肌肉无力，严重者可出现关节脱位[4-6]。国内外关于RA的动物模型的制备方法有许多种，并针对不同的研究方向选择不同的制备方法并加以改善。本文即阐述目前关于RA动物模型制备及模型评价的常用方法。
1 造模方法及评价
1.1 西医造模方法
1.1.1 佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）模型 关于AA的制备，Pottier等[7]选用结核分枝杆菌加入弗氏不完全佐剂中（incomplete freund's adjuvant，IFA），制成含5 mg·mL-1（Mtb）的油包水乳剂。在小鼠尾根部皮下注射100 μL致炎。刘健等[8]选用卡介苗，并按石蜡油与羊毛脂1∶1比例配置成完全佐剂于大鼠的右后足皮内注射
0.1 mL致炎。
AA的原理目前被接受的是分子模拟理论，结核分枝杆菌上的蛋白分子与关节滑膜上的相似，可以被同一株T细胞所识别，从而诱发抗原抗体反应，引发炎症。
AA的改进方面，彭传玉等[9]实验研究发现，注射0.15 mL弗氏完全佐剂（complete freund's adjuvant，CFA）模型最接近人类病变。改变石蜡油和羊毛脂的比例可以依实验要求配置更加理想的CFA，现常使用的配比为羊毛脂∶石蜡油1∶1，1∶2，1∶3，2∶3等。李伟等[10]选用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）于大鼠踝关节和髌骨下的脂肪垫注射加强免疫，之后发现可以在8 h左右出现部分急性炎症症状，2 d时肿胀达峰值，能够明显缩短免疫时间，提高造模效果。
评价：Pottier等[7]发现，炎症初期出现足跖趾关节、踝关节肿胀，之后发展至整个四肢，20 d左右达到高峰，之后降低。Zheng等[11]通过影像学检查发现骨的改变，骨小梁、组织矿物质含量降低，骨组织出现不可逆的病变。薛盟举[12]发现，继发病变可以出现行动不便，耳部及尾部有关节炎小结的出现，并伴有变异性角膜炎等。
1.1.2 胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型 关于CIA的制备，韩冰等[13-14]将牛源性Ⅱ型胶原细胞与IFA混合，从脊柱两旁皮下多点或从尾部注射，每只鼠注射1 mL，1周后注射0.5 mL加强免疫一次。康建功等[15]将牛源性Ⅱ型胶原细胞与等体积的CFA混合。在大鼠颈背部多点皮下注射，总量0.5 mL。21 d后注射0.3 mL加强免疫。Zimmerman等[16-17]将牛胶原蛋白与CFA按照1∶1乳化混合，在小鼠的尾根部多点注射，共注射0.1 mL，21 d后将牛胶原蛋白与IFA按照等体积混合，在尾根部或者爪部注射
0.1 mL加强免疫。
Ⅱ型胶原是人软骨基质的主要成分，1977年Trentham等[18]首次发现Ⅱ型胶原，并以此成功诱导了RA大鼠。Park等[19]认为，Ⅱ型胶原细胞使活化的B细胞产生特异性抗体，在关节部位与胶原蛋白结合形成免疫复合物，活化了补体系统导致炎症反应，使中性粒细胞、T细胞聚集至关节部位，进一步激发活化，使关节周围的滑膜组织不断增生，形成血管翳，侵袭周围的骨组织，导致广泛的骨质疏松，骨皮质变薄，同时也伴有骨质增生的现象。
评价：①关节：大鼠足关节出现红肿，活动受限，随着炎症进展，大鼠可出现皮肤溃疡或关节变形。②病理方面：滑膜细胞明显增生，层次增多，排列紊乱，并可见滑膜脂肪水肿，炎性细胞浸润及肉芽组织形成[13-15]。③免疫学改变：张敏娜[20]发现，红细胞沉降率明显升高，中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞浸润，出现高滴度的IgG抗体，破骨细胞异常增生。
常用的试剂有牛源性、鸡源性、鼠源性或者人胶原细胞。文献中多选用牛源性Ⅱ型胶原细胞。传统的CIA造模多选用牛源性Ⅱ型胶原细胞与IFA混合制作的乳化剂；近年来，多选用牛源性Ⅱ型胶原细胞与CFA混合制作的乳化剂，原因可能是大鼠对于CFA较为敏感，造模的成功率也更高。国外制作RA的动物模型多选用Lewis大鼠，国内多选用Lewis、SD或者Wistar大鼠，小鼠多选用DBA-1小鼠。张云等[21]研究各种鼠的品种比较表明，小鼠的发病时间较大鼠晚；赵宏艳等[22]发现，Lewis比SD、Wistar大鼠关节评分低，Wistar大鼠CIA组脾脏系数明显高于正常对照组，Wistar雌性CIA 组肾上腺系数较正常对照组，明显升高。Kannan等[23]将羊等大型动物作为RA的造模动物，以弥补鼠或者兔体积较小容易出现提取组织量不够的缺陷。
1.1.3 卵蛋白诱导的关节炎模型 魏东明等[24-25]将卵蛋白溶液与等体积IFA混合，在家兔皮下注射1 mL。28 d后，在关节腔内注射3%卵蛋白溶液
0.2 mL进行二次致敏。
卵蛋白诱导首次出现在1962年，姜辉等[26]认为，关节内抗原持续存在，刺激滑膜细胞出现抗体，并形成抗原-抗体-C3复合物，产生局部的炎症反应，产生大量的淋巴细胞、单核巨噬细胞及中性粒细胞浸润，产生血管翳，从而导致骨破坏。 评价：魏东明等[24-25]发现，家兔关节出现肿胀，活动度下降，关节僵硬，不能负重甚至关节变形。
1.1.4 降植烷诱导的关节炎（pristine-induced arthritis，PIA）模型 赵义等[27]在大鼠尾根部共注射降植烷150 mg，制作模型。
评价：①关节：大鼠出现关节肿胀，累及远端关节，关节炎症状呈慢性反复及进行性加重。②免疫学改变：红细胞沉降率明显升高[27]。③影像及病理：关节滑膜增生、软骨组织及骨组织呈典型的关节炎病变[28]。
Abdalmula等[29]发现，降植烷诱导的模型原本用于大鼠的模型制作，但目前已被发现可以诱导一定的小鼠RA及系统性红斑狼疮的模型。
1.1.5 其他方法 软骨低聚体基质蛋白（COMP）诱导：使用COMP与弗氏不完全佐剂混合，经尾部皮下注射。佐剂角叉菜胶诱导：使用CFA与角叉菜胶在足趾皮下注射。转基因鼠：Myers等[30]发现，HLA-DR1转基因鼠在使用胶原诱导造模时的成功率比正常小鼠的成功率高。油诱导：石磊
等[31]发现，只适用于DA大鼠，将微量的IFA注射于大鼠的皮下。甲基双十八烷基铵溴化物诱导：与磷酸缓冲液融合注射于大鼠皮下。
1.2 常用的中医造模方法 RA属中医学“痹证”范畴，主要的病理因素是外感风寒湿邪或者风湿热邪日久入侵机体。金祝秋等[32-33]通过中医的病机学说模拟病因，让大鼠在冰水或热水合并强风的条件下造模。
1.3 中西医结合造模方法 肖长虹等[33]在CIA的造模基础上从造模第1天起加入风寒湿或者风湿热的外因诱导。徐世杰等[34-35]在CIA的基础上利用去势等方法制出肾虚CIA模型。
2 对评价标准的评价
关于实验动物是否造模成功的评价标准，种类较多且较为混乱，常用的有以下4种评价标准。①关节肿胀程度及行为学改变：多采用关节炎指数评分法，此种方法较直观，但是没有统一的标准，且关于轻度肿胀、中度肿胀、重度肿胀的评价没有明确的标准，可能会对模型分级存在争议；或测量肿胀率，即测量动物致炎前后的足容积改变，但改变较小时可能会导致结果不精准。②影像学检查：X线下观察骨改变，贴近临床，但对于需要反复评价的动物，可能会因辐射而对实验结果产生影响；超声检测对检测者的要求较高，一般实验室不易实
施；MRI或者PET-CT花费较高，一般在动物实验时也不加考虑。③免疫学检查：采用血清或者关节液中鉴定红细胞沉降率、类风湿因子、中性粒细胞、淋巴细胞等指标，临床也多采用此法，或者测定白细胞介素（IL）-6、IL-1、抗Ⅱ型胶原的量的方法，但大鼠的病变组织的关节液较少，不易抽取；且大鼠的安全取血量约为1 mL左右，如果要完成多种因子的测定需处死大鼠，可能会影响实验的连贯性，而且不同的造模方法对于免疫学的改变各有偏颇，不能完全代表临床改变。④病理学改变：定期取部分大鼠处死将病变关节制成病理切片观察，此种制作方法较为复杂，且观察不具有连贯性，但是可以明确诊断，观察到滑膜、炎性细胞、胶原细胞、血管翳的形成等多种指标，也可以长期保存。
3 讨 论
比较各种造模方法发现，AA和CIA均有骨质的改变，AA的制备方法较简单，发病快，肿胀较明显，有大量的炎细胞浸润，病理学改变与临床相似，都是从关节边缘开始进行性骨破坏，但缺乏慢性病理过程，有一定的局限性。CIA造模动物的骨性改变更加明显，RA的持续时间更长，但起病相对较缓慢，没有病情的波动及反复，也没有关节外皮肤及眼部表现的改变。Ren等[36]发现，卵蛋白多用来诱导兔、羊等较大的关节，成功率高，但是免疫学指标与病程特点与临床有差别。罗辉宇等[37]发现，PIA诱导的Lewis大鼠在临床表现尤其是类风湿因子的表达方面与临床较为相似。石磊等[31]发现，油诱导和甲基双十八烷基铵溴化物诱导关节可出现红肿，但红肿程度较低，且不出现CII抗体。将传统的中医病因病机与西医的造模方法相结合是传统医学实验的进步，目前已有将风寒湿、风湿热、肾虚、脾虚等与CIA或者AA相结合的造模方法，但薛盟举[12]认为，人体是个复杂的整体，人工模拟的风、寒、湿、热病因与人体所感受的自然界的病因不完全相符，故此种方法会存在争议，且可能出现造模时间长，且成功率不高的可能性。
关节肿胀在所有造模中均有涉及，而AA的造模中常选用X线或者病理与免疫检查组合的检验方法作为评价标准，CIA中多直接采用病理和免疫结合的方法。
在药物实验时，张巍等[38]选择造模成功的动物，通过酶消化的方法提取出关节中主要导致RA的成纤维细胞体外培养，并加以试验药物，观察细胞的变化。此种方法比动物实验操作简单，但是RA是由复杂的多原因导致的自身免疫性疾病，而仅用细胞研究不能真实地模拟人体的整个内环境的变化等，故仍不能代替动物实验。
因此，要建立更加贴近临床的动物模型还需不断研究。多种评价标准联合使用是如今动物模型评价的主流方向，但建立可以连续性观察、更加规范化、更加贴近临床的评价标准仍需不断努力。
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收稿日期：2014-11-27；修回日期：2015-01-12