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[摘要]目的 动态观察黄芪山甲方（HQSJ）对大鼠肾间质纤维化（RIF）多靶点的治疗作用，探讨HQSJ方在不同阶段的可能作用机制。 方法 实验采用UUO大鼠模型，将雄性SD大鼠54只随机分成3组：假手术组（Sham）、模型组（UUO）、治疗组（HQSJ）。术后14、28、56d分别处死6只大鼠，观察肾功能变化；对肾小管基底膜（TBM）、肾小管萎缩、炎细胞浸润及间质纤维化情况进行半定量评分；采用免疫组织化学法及RTPCR法检测肾组织TGF-β1、FN蛋白及mRNA的表达。结果 （1）肾功能方面：与Sham组比较，UUO及HQSJ组大鼠BUN、SCr值在14～28d进行性升高，在28～56d相对稳定。HQSJ组大鼠BUN、SCr值在同一时相均较UUO组低（P<0.05）。（2）病理改变方面：与Sham组比较，UUO及HQSJ组大鼠炎细胞浸润与肾间质慢性病变程度均有增高趋势，同一时相比较差异均有统计学意义（P<0.05）。UUO与HQSJ组比较，炎细胞浸润程度在14、28d有统计学意义（P<0.05），56d无统计学意义（P>0.05）；肾间质慢性病变程度14、28、56d均有统计学意义（P<0.05）。（3）TGF-β1、FN表达：与Sham组比较，UUO及HQSJ组TGF-β1、FN表达均增高，在同一时相比较均有统计学意义（P<0.05）；与UUO组比较，HQSJ组TGF-β1、FN在14、28、56d的表达均不同程度下降（P<0.05）；同一时相下降幅度比较：免疫组化示TGF-β1、FN蛋白阳性率分别下降64%、47%、7%及82%、72%、70%；RT-PCR法检测TGF-β1、FN的mRNA分别下降72%、57%、27%及83%、72%、68%。 结论 HQSJ方抗肾间质纤维化的多靶点作用，可能与减少炎性细胞、抑制TGF-β1分泌，减轻肾脏固有细胞的活化及转分化，从而减少细胞外基质的沉积有关。其作用从病变早期开始，在14～28d主要是减少炎性细胞浸润和降低TGF-β1表达，对FN的抑制作用贯穿始终。
[关键词]黄芪山甲方；肾间质纤维化；TGF-β1；FN
[中图分类号]R277.5 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2014）20-07-07
Multi-target inhibition of Huangqishanjia （HQSJ） on renal interstitial fibrosis（RIF）
CAI Hongyu YANG Guanghui WAN Qiang ZHANG Juan FU Zhihui GAO Yanxia
Department of Nephropathy， Shanxi Province Chinese Medicine Hospital， Taiyuan 030012， China
[Abstract]Objective To observe the multi-target therapeutic effect of HQSJ for RIF of mice and discuss possible action mechanism of HQSJ in different stages. Methods UUO mice mode was adopted and 54 male SD mice were randomly divided into 3 groups as fake operation group （Sham）， model group （UUO） and treatment group （HQSJ）. 6 mice were killed separately on 14d， 28d and 56d after operation and their kidney function changes were observed； TBM， renal tubular atrophy， inflammatory cell infiltration and RIF were given semi-quantitative scores； TGF-β1， FN protein and mRNA expressions of renal tissues were detected by immunohistochemical method and RT-PCR method. Results （1） On kidney function， compared with Sham group， BUN and SCr values of UUO and HQSJ group were developed during 14-28d and stayed relatively steady during 28-56d. BUN and SCr values of HQSJ group were both lower than UUO group in the same time phase （P<0.05）. （2） On pathological chages， compared with Sham group， inflammatory cell infiltration and renal interstitial chronic lesion degrees of mice of UUO and HQSJ group both had a increasing trend in the same time phase （P<0.05）. There were significant differences between inflammatory cell infiltration of UUO group and HQSJ group on 14 and 28d （P<0.05） but no significant difference on 56d （P>0.05）； there were significant differences on renal interstitial chronic lesion degrees on 14， 28 and 56d （P<0.05）. （3） On TGF-β1， FN expressions： compared with Sham group， TGF-β1 and FN expressions of UUO and HQSJ group both rose in the same time phase （P<0.05）； compared with UUO group， TGF-β1 and FN expressions on 14， 28 and 56d of HQSJ group all declined to different extents （P<0.05）； decline degree of the same time phase comparison； immunohistochemical method showed that positive rates of TGF-β1 and FN protein declined separately by 64%， 47%， 7% and 82%， 72%， 70%； RT-PCR method showed that mRNA of TGF-β1 and FN declined separately by 72%， 57%， 27%% and 83%， 72%， 68%. Conclusion Multi-target therapeutic effect of HQSJ for RIF may related with decrease of ECM deposition caused by decrease of inflammatory cells， inhibition of TGF-β1 secretion， alleviation of excitation and transdifferentiation of renal inherent cells. Its action started from early lesion， mainly reducing inflammatory cell infiltration and decreasing TGF-β1 expression， and inhibition to FN throughout the whole process.
[Key words]Huangqishanjia； Renal interstitial fibrosis； TGF-β1； FN
RIF是各种原因造成的肾小管间质病变的最终结果，是导致慢性肾功能衰竭的主要因素之一，其特征是正常肾小管和肾间质结构被大量聚集的细胞外基质所代替[1]。中药因其成分及配伍的多样性在防治肾间质纤维化领域中突显了中医特色及优势。本研究应用UUO致RIF大鼠模型，并以HQSJ方进行干预治疗，通过观察HQSJ方对UUO大鼠的肾功能、肾脏病理形态学、TGF-β1、FN表达的影响，探讨其抗肾间质纤维化的多靶点作用机制，并通过动态观察，了解HQSJ方何时开始起效以及在疾病不同发展阶段的动态作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 选择健康雄性Wistar大鼠54只，平均体重为（255.0±12.1）g，由山西省中医药动物实验中心提供。
1.1.2 主要试剂 HQSJ方由山西省中医院中药房提供。TGF-β1、FN、抗体及原位杂交试剂由武汉博士德生物有限公司提供。Trizol试剂购于上海生工生物科技有限公司，采用Fermentas公司的K1622逆转录（RT）试剂盒和Roche公司的荧光定量试剂盒，抗TGF-β1、FN抗体由美国SANTA CRUZ公司提供。
1.2 方法
动物模型制备及分组：将54只大鼠随机分为3组：Sham组、UUO组、HQSJ组。其中UUO组、HQSJ组行单侧输尿管梗阻致RIF模型：3.5%水合氯醛以1mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，取右侧卧位，背部左肋下备皮，常规消毒后沿腋后线从左肋下向尾部方向切开皮肤，钝性分离皮下组织及肌层，打开腹腔，分离左侧输尿管并行双线结扎，然后剪断输尿管，逐层缝合。Sham组打开腹腔后即缝合。术后各组肌肉注射青霉素以预防感染。Sham组、UUO组于术前3d开始每天2mL蒸馏水灌胃给药；HQSJ组于术前3d开始每天中药汤剂灌胃给药；中药用药量均相当于成人每日每公斤体重的15倍。术后各时段麻醉后腹主动脉取血，送检化验室化验。取血后处死大鼠，剖取梗阻左肾，分别留取光镜、免疫标本送检病理室。
1.3 检测项目
1.3.1 肾功能 全自动生化分析仪检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。
1.3.2 病理改变 200倍光镜下，每张切片随机选择5个视野，肾间质慢性病变（CC）有3个参数判定TBM增厚、肾小管萎缩、间质纤维化，每个参数按0～3分评定（0=正常，1=轻度损伤，2=中度损伤，3=重度损伤），每个样本小管间质的评分为0～9分。肾间质炎细胞浸润（CIS）情况评分：无（0分）、局灶细胞浸润（1分）、多灶细胞浸润（2分）、弥漫细胞浸润（3分）。
1.3.3 免疫组织化学测定TGF-β1、FN蛋白阳性面积 随机选取5个不重叠的视野，在200倍光镜下应用免疫组化染色测量每个视野内阳性染色面积占整个视野面积的百分比作半定量分析测定值。1.3.4 RT-PCR检测TGF-β1、FN的mRNA的表达 Trizol试剂提取肾组织总RNA，逆转录生成CDNA，以CDNA为模板在TAQDNA聚合酶催化下进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性10min，活化Tag酶，94℃ 15s，60℃ 60s，45个循环结束。荧光定量PCR读取CT （cycle threshold）值，按文献[2]方法计算目的基因的2-ΔΔCT值，表示实验组测定基因的表达相对与正常对照组样本表达的变化倍数，以目的基因2-ΔΔCT值为参数半定量分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计量资料用（x±s）表示；各组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾功能
各时间点Sham组的BUN和SCr均保持相对稳定水平；UUO组及HQSJ组BUN和SCr逐渐升高，同时相与Sham组比较有统计学意义（P<0.05）；HQSJ组可以降低UUO大鼠的BUN和SCr，同时相与UUO组比较有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 肾脏病理变化
Sham组几乎无明显改变，UUO组与HQSJ组均有不同程度的病理改变。HQSJ治疗后，肾脏组织形态学变化均较UUO组明显减轻，但并未完全消失。与UUO比较，HQSJ组炎细胞浸润程度在14、28d均减轻（P<0.05），56d无明显改变（P>0.05）；肾间质慢性病变程度14、28、56d均减轻（P<0.05）。见表2。
2.3 免疫组织化学测定TGF-β1、FN蛋白的表达
Sham组几乎无TGF-β1、FN表达。与Sham组比较，UUO组及HQSJ组在14、28、56d肾组织内见不同程度阳性棕褐色染色（P<0.05）。与UUO组比较，HQSJ组各时相棕褐色染色面积减轻（P<0.05）。TGF-β1在14、28、56d较UUO组下降幅度分别为64%、47%、7%，FN下降幅度分别为82%、72%、70%。见表3。
2.4 RT-PCR检测TGF-β1、FN的mRNA的表达
与Sham组比较，RT-PCR检测TGF-β1、FN的mRNA的表达均增高（P<0.05）。与UUO组比较，HQSJ组各时相表达减少（P<0.05）。TGF-β1在14、28、56d较UUO组下降幅度分别为72%、57%、27%，FN下降幅度分别为3%、72%、68%。见表4。
3 讨论
RIF发病机制目前已知缺氧、感染、蛋白尿、免疫沉积物、化学因子、细胞因子、代谢性酸中毒、脂质、有毒物质等是引起CKD进展的主要病因，各种致病原因导致肾脏局部炎性细胞浸润、肾脏固有细胞损伤并转分化，炎性细胞及活化的固有细胞产生多种促纤维化因子，尤以TGF-β1为代表，主动参与ECM的合成；另外多种细胞因子通过旁分泌和自分泌方式，又促进肾脏固有细胞的增殖、活化及转分化，产生大量以纤维粘蛋白（FN）和胶原（尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原）为代表的ECM的分泌[3-4]。中药复方具有多成分的物质基础，理论上具有多途径与多靶点的作用特点，目前中药抗RIF的作用备受关注。HQSJ方是我院全国名老中医孙郁芝教授经过多年临床实践确立的用于治疗CKD的基础方，经大量临床研究在降低尿蛋白、改善肾功能、延缓CKD进展方面疗效确切[5]。为探讨其抗RIF的多靶点作用机制，并通过动态观察，了解HQSJ方何时开始起效以及在疾病不同发展阶段的动态作用机制，我们采用UUO大鼠进行了动态相关研究。
对UUO造模后14、28、56d肾功能进行观察，各时间点Sham组的BUN和SCr均保持相对稳定水平[6-7]。模型组14d时，肾功能即可出现异常，到28d时血肌酐及尿素氮增高幅度最高，56d较28d升高幅度不明显，考虑单侧输尿管梗阻后肾功能有一个急性损伤，故可见血肌酐及尿素氮的积聚增高，随着时间延长对侧肾脏开始代偿，故可见血肌酐及尿素氮的明显下降，最后对侧肾脏亦失去代偿，故可见肾功能不能完全恢复[8-9]。经HQSJ方治疗后14～56d，肾脏病理变化较模型组减轻，同时肾功能也得到改善，在28d时血肌酐及尿素氮下降明显低于模型组，56d时下降不明显，说明HQSJ方的治疗作用贯穿始终[10-11]。
肾脏病理观察，Sham组几乎无明显病理改变，UUO组与HQSJ组的病理损伤都呈慢性进展的趋势。UUO组造模后14、28、56d出现进行性肾小管间质损伤，病变在14d已出现明显的肾间质炎症细胞浸润及肾小管扩张或萎缩、间质纤维化的病理变化。HQSJ方治疗后，肾脏组织形态学变化均较UUO组明显减轻，但并未完全消失。UUO及HQSJ组比较，炎细胞浸润程度在14、28d有统计学意义（P<0.05），56d无统计学意义（P>0.05）；肾间质慢性病变程度14、28、56d有统计学意义（P<0.05）。说明其早期主要对炎症细胞有抑制作用，对慢性病变程度的作用持续始终。提示HQSJ方对CKD治疗持续有效，早期疗效显著[12-13]。
免疫组织化学测定TGF-β1、FN蛋白阳性面积及RT-PCR检测TGF-β1、FN的mRNA的表达显示：（1）Sham组几乎无表达，UUO组及HQSJ组14、28、56d阳性表达渐加重，HQSJ组较UUO组表达明显减弱。（2）与Sham组比较，UUO及HQSJ组TGF-β1、FN蛋白表达均增高，在同一时相比较均有统计学意义（P<0.05）。（3）与UUO组比较，TGF-β1蛋白及mRNA的表达在14、28、56d下降幅度分别为64%、47%、7%与72%、57%、27%；FN蛋白及mRNA的表达下降幅度分别为82%、72%、70%与83%、72%、68%。
实验说明HQSJ在14～28d主要减少炎性细胞浸润，TGF-β1表达分泌为主，提示其肾脏保护作用从病变早期开始，主要表现为可能减轻各种炎性细胞及包括纤维化相关的细胞因子的分泌。从FN表达在14、28、56d下降幅度持续较高的数据提示，HQSJ可以持续减少肾脏固有细胞的活化及细胞外基质成分沉积，从而减轻RIF，延缓CKD的进展。
[参考文献]
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[6]傅淑霞，邢玲玲，段建召，等.肾小球疾病患者高血压病患病率的影响因素分析[J].中国临床医学，2013，13（2）：125-128.
[7]高明，纽亚珍，冯娜，等.慢性肾脏病肾皮髓质表观弛豫率与肾功能的相关性研究[J].中国医师进修杂志，2014，37（13）：157-158.
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[10]须冰，王维熙，陈以平.中医及中西医结合治疗IgA肾病疗效分析[J].中国中西医结合肾病杂志，2011，12（4）：134-138.
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[13]李亚妤，俞东容，胡云琴，等.慢性原发性肾脏病3期肾虚证与病理相关性研究[J].中国中西医结合肾病杂志，2013，14（2）：197-199.
（收稿日期：2014-07-18）
[关键词]黄芪山甲方；肾间质纤维化；TGF-β1；FN
[中图分类号]R277.5 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2014）20-07-07
Multi-target inhibition of Huangqishanjia （HQSJ） on renal interstitial fibrosis（RIF）
CAI Hongyu YANG Guanghui WAN Qiang ZHANG Juan FU Zhihui GAO Yanxia
Department of Nephropathy， Shanxi Province Chinese Medicine Hospital， Taiyuan 030012， China
[Abstract]Objective To observe the multi-target therapeutic effect of HQSJ for RIF of mice and discuss possible action mechanism of HQSJ in different stages. Methods UUO mice mode was adopted and 54 male SD mice were randomly divided into 3 groups as fake operation group （Sham）， model group （UUO） and treatment group （HQSJ）. 6 mice were killed separately on 14d， 28d and 56d after operation and their kidney function changes were observed； TBM， renal tubular atrophy， inflammatory cell infiltration and RIF were given semi-quantitative scores； TGF-β1， FN protein and mRNA expressions of renal tissues were detected by immunohistochemical method and RT-PCR method. Results （1） On kidney function， compared with Sham group， BUN and SCr values of UUO and HQSJ group were developed during 14-28d and stayed relatively steady during 28-56d. BUN and SCr values of HQSJ group were both lower than UUO group in the same time phase （P<0.05）. （2） On pathological chages， compared with Sham group， inflammatory cell infiltration and renal interstitial chronic lesion degrees of mice of UUO and HQSJ group both had a increasing trend in the same time phase （P<0.05）. There were significant differences between inflammatory cell infiltration of UUO group and HQSJ group on 14 and 28d （P<0.05） but no significant difference on 56d （P>0.05）； there were significant differences on renal interstitial chronic lesion degrees on 14， 28 and 56d （P<0.05）. （3） On TGF-β1， FN expressions： compared with Sham group， TGF-β1 and FN expressions of UUO and HQSJ group both rose in the same time phase （P<0.05）； compared with UUO group， TGF-β1 and FN expressions on 14， 28 and 56d of HQSJ group all declined to different extents （P<0.05）； decline degree of the same time phase comparison； immunohistochemical method showed that positive rates of TGF-β1 and FN protein declined separately by 64%， 47%， 7% and 82%， 72%， 70%； RT-PCR method showed that mRNA of TGF-β1 and FN declined separately by 72%， 57%， 27%% and 83%， 72%， 68%. Conclusion Multi-target therapeutic effect of HQSJ for RIF may related with decrease of ECM deposition caused by decrease of inflammatory cells， inhibition of TGF-β1 secretion， alleviation of excitation and transdifferentiation of renal inherent cells. Its action started from early lesion， mainly reducing inflammatory cell infiltration and decreasing TGF-β1 expression， and inhibition to FN throughout the whole process.
[Key words]Huangqishanjia； Renal interstitial fibrosis； TGF-β1； FN
RIF是各种原因造成的肾小管间质病变的最终结果，是导致慢性肾功能衰竭的主要因素之一，其特征是正常肾小管和肾间质结构被大量聚集的细胞外基质所代替[1]。中药因其成分及配伍的多样性在防治肾间质纤维化领域中突显了中医特色及优势。本研究应用UUO致RIF大鼠模型，并以HQSJ方进行干预治疗，通过观察HQSJ方对UUO大鼠的肾功能、肾脏病理形态学、TGF-β1、FN表达的影响，探讨其抗肾间质纤维化的多靶点作用机制，并通过动态观察，了解HQSJ方何时开始起效以及在疾病不同发展阶段的动态作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 选择健康雄性Wistar大鼠54只，平均体重为（255.0±12.1）g，由山西省中医药动物实验中心提供。
1.1.2 主要试剂 HQSJ方由山西省中医院中药房提供。TGF-β1、FN、抗体及原位杂交试剂由武汉博士德生物有限公司提供。Trizol试剂购于上海生工生物科技有限公司，采用Fermentas公司的K1622逆转录（RT）试剂盒和Roche公司的荧光定量试剂盒，抗TGF-β1、FN抗体由美国SANTA CRUZ公司提供。
1.2 方法
动物模型制备及分组：将54只大鼠随机分为3组：Sham组、UUO组、HQSJ组。其中UUO组、HQSJ组行单侧输尿管梗阻致RIF模型：3.5%水合氯醛以1mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，取右侧卧位，背部左肋下备皮，常规消毒后沿腋后线从左肋下向尾部方向切开皮肤，钝性分离皮下组织及肌层，打开腹腔，分离左侧输尿管并行双线结扎，然后剪断输尿管，逐层缝合。Sham组打开腹腔后即缝合。术后各组肌肉注射青霉素以预防感染。Sham组、UUO组于术前3d开始每天2mL蒸馏水灌胃给药；HQSJ组于术前3d开始每天中药汤剂灌胃给药；中药用药量均相当于成人每日每公斤体重的15倍。术后各时段麻醉后腹主动脉取血，送检化验室化验。取血后处死大鼠，剖取梗阻左肾，分别留取光镜、免疫标本送检病理室。
1.3 检测项目
1.3.1 肾功能 全自动生化分析仪检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。
1.3.2 病理改变 200倍光镜下，每张切片随机选择5个视野，肾间质慢性病变（CC）有3个参数判定TBM增厚、肾小管萎缩、间质纤维化，每个参数按0～3分评定（0=正常，1=轻度损伤，2=中度损伤，3=重度损伤），每个样本小管间质的评分为0～9分。肾间质炎细胞浸润（CIS）情况评分：无（0分）、局灶细胞浸润（1分）、多灶细胞浸润（2分）、弥漫细胞浸润（3分）。
1.3.3 免疫组织化学测定TGF-β1、FN蛋白阳性面积 随机选取5个不重叠的视野，在200倍光镜下应用免疫组化染色测量每个视野内阳性染色面积占整个视野面积的百分比作半定量分析测定值。1.3.4 RT-PCR检测TGF-β1、FN的mRNA的表达 Trizol试剂提取肾组织总RNA，逆转录生成CDNA，以CDNA为模板在TAQDNA聚合酶催化下进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性10min，活化Tag酶，94℃ 15s，60℃ 60s，45个循环结束。荧光定量PCR读取CT （cycle threshold）值，按文献[2]方法计算目的基因的2-ΔΔCT值，表示实验组测定基因的表达相对与正常对照组样本表达的变化倍数，以目的基因2-ΔΔCT值为参数半定量分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计量资料用（x±s）表示；各组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾功能
各时间点Sham组的BUN和SCr均保持相对稳定水平；UUO组及HQSJ组BUN和SCr逐渐升高，同时相与Sham组比较有统计学意义（P<0.05）；HQSJ组可以降低UUO大鼠的BUN和SCr，同时相与UUO组比较有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 肾脏病理变化
Sham组几乎无明显改变，UUO组与HQSJ组均有不同程度的病理改变。HQSJ治疗后，肾脏组织形态学变化均较UUO组明显减轻，但并未完全消失。与UUO比较，HQSJ组炎细胞浸润程度在14、28d均减轻（P<0.05），56d无明显改变（P>0.05）；肾间质慢性病变程度14、28、56d均减轻（P<0.05）。见表2。
2.3 免疫组织化学测定TGF-β1、FN蛋白的表达
Sham组几乎无TGF-β1、FN表达。与Sham组比较，UUO组及HQSJ组在14、28、56d肾组织内见不同程度阳性棕褐色染色（P<0.05）。与UUO组比较，HQSJ组各时相棕褐色染色面积减轻（P<0.05）。TGF-β1在14、28、56d较UUO组下降幅度分别为64%、47%、7%，FN下降幅度分别为82%、72%、70%。见表3。
2.4 RT-PCR检测TGF-β1、FN的mRNA的表达
与Sham组比较，RT-PCR检测TGF-β1、FN的mRNA的表达均增高（P<0.05）。与UUO组比较，HQSJ组各时相表达减少（P<0.05）。TGF-β1在14、28、56d较UUO组下降幅度分别为72%、57%、27%，FN下降幅度分别为3%、72%、68%。见表4。
3 讨论
RIF发病机制目前已知缺氧、感染、蛋白尿、免疫沉积物、化学因子、细胞因子、代谢性酸中毒、脂质、有毒物质等是引起CKD进展的主要病因，各种致病原因导致肾脏局部炎性细胞浸润、肾脏固有细胞损伤并转分化，炎性细胞及活化的固有细胞产生多种促纤维化因子，尤以TGF-β1为代表，主动参与ECM的合成；另外多种细胞因子通过旁分泌和自分泌方式，又促进肾脏固有细胞的增殖、活化及转分化，产生大量以纤维粘蛋白（FN）和胶原（尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原）为代表的ECM的分泌[3-4]。中药复方具有多成分的物质基础，理论上具有多途径与多靶点的作用特点，目前中药抗RIF的作用备受关注。HQSJ方是我院全国名老中医孙郁芝教授经过多年临床实践确立的用于治疗CKD的基础方，经大量临床研究在降低尿蛋白、改善肾功能、延缓CKD进展方面疗效确切[5]。为探讨其抗RIF的多靶点作用机制，并通过动态观察，了解HQSJ方何时开始起效以及在疾病不同发展阶段的动态作用机制，我们采用UUO大鼠进行了动态相关研究。
对UUO造模后14、28、56d肾功能进行观察，各时间点Sham组的BUN和SCr均保持相对稳定水平[6-7]。模型组14d时，肾功能即可出现异常，到28d时血肌酐及尿素氮增高幅度最高，56d较28d升高幅度不明显，考虑单侧输尿管梗阻后肾功能有一个急性损伤，故可见血肌酐及尿素氮的积聚增高，随着时间延长对侧肾脏开始代偿，故可见血肌酐及尿素氮的明显下降，最后对侧肾脏亦失去代偿，故可见肾功能不能完全恢复[8-9]。经HQSJ方治疗后14～56d，肾脏病理变化较模型组减轻，同时肾功能也得到改善，在28d时血肌酐及尿素氮下降明显低于模型组，56d时下降不明显，说明HQSJ方的治疗作用贯穿始终[10-11]。
肾脏病理观察，Sham组几乎无明显病理改变，UUO组与HQSJ组的病理损伤都呈慢性进展的趋势。UUO组造模后14、28、56d出现进行性肾小管间质损伤，病变在14d已出现明显的肾间质炎症细胞浸润及肾小管扩张或萎缩、间质纤维化的病理变化。HQSJ方治疗后，肾脏组织形态学变化均较UUO组明显减轻，但并未完全消失。UUO及HQSJ组比较，炎细胞浸润程度在14、28d有统计学意义（P<0.05），56d无统计学意义（P>0.05）；肾间质慢性病变程度14、28、56d有统计学意义（P<0.05）。说明其早期主要对炎症细胞有抑制作用，对慢性病变程度的作用持续始终。提示HQSJ方对CKD治疗持续有效，早期疗效显著[12-13]。
免疫组织化学测定TGF-β1、FN蛋白阳性面积及RT-PCR检测TGF-β1、FN的mRNA的表达显示：（1）Sham组几乎无表达，UUO组及HQSJ组14、28、56d阳性表达渐加重，HQSJ组较UUO组表达明显减弱。（2）与Sham组比较，UUO及HQSJ组TGF-β1、FN蛋白表达均增高，在同一时相比较均有统计学意义（P<0.05）。（3）与UUO组比较，TGF-β1蛋白及mRNA的表达在14、28、56d下降幅度分别为64%、47%、7%与72%、57%、27%；FN蛋白及mRNA的表达下降幅度分别为82%、72%、70%与83%、72%、68%。
实验说明HQSJ在14～28d主要减少炎性细胞浸润，TGF-β1表达分泌为主，提示其肾脏保护作用从病变早期开始，主要表现为可能减轻各种炎性细胞及包括纤维化相关的细胞因子的分泌。从FN表达在14、28、56d下降幅度持续较高的数据提示，HQSJ可以持续减少肾脏固有细胞的活化及细胞外基质成分沉积，从而减轻RIF，延缓CKD的进展。
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（收稿日期：2014-07-18）