【摘 要】
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目的 采用原核表达和亲和层析的方法获得人细胞角蛋白18（CK18）。方法 利用高保真聚合酶链式反应（PCR）法克隆人CK18基因的蛋白编码区，TA克隆入pMD18-T载体中；经筛选和鉴定后，将CK18基因编码区插入原核表达载体pGEX-4t-1中，构建重组质粒pGEX-CK18GST；将重组质粒导入感受态细菌Rosetta（DE3）中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导CK18融合蛋白
【机 构】
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贵阳市妇幼保健院&贵阳市儿童医院儿童重症监护病房
【基金项目】
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国家自然科学基金（81560390）； 2020年贵州省大学生创新创业训练计划项目（S202010660004）；
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目的 采用原核表达和亲和层析的方法获得人细胞角蛋白18（CK18）。方法 利用高保真聚合酶链式反应（PCR）法克隆人CK18基因的蛋白编码区，TA克隆入pMD18-T载体中；经筛选和鉴定后，将CK18基因编码区插入原核表达载体pGEX-4t-1中，构建重组质粒pGEX-CK18GST；将重组质粒导入感受态细菌Rosetta（DE3）中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导CK18融合蛋白（GST-CK18）表达，并用GST亲和层析分离纯化CK18蛋白；用体外磷酸化、免疫组化等方法验证CK18磷酸化位点及其对细胞的影响。结果 成功克隆人CK18基因蛋白编码区，构建了原核表达质粒pGEX-CK18GST，表达了GST-CK18并获得纯化蛋白，体外磷酸化、免组织化学方法均证实CK18的52位丝氨酸磷酸化可以导致细胞骨架重排和细胞形态变化。结论 成功获得纯化的人CK18蛋白，为体外研究CK18和蛋白激酶之间的关系奠定了前期基础。
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