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【关键词】高频电刺激；大鼠；神经元；影响
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.602文章编号：1004-7484（2014）-05-2870-02苍白球（globus pallidus，GP）在大鼠（entopeduncular nucleus，EP）作为基底节重要的输出核团，与（pedunculopontine nucleus，PPN）有着密切的联系。本实验用电刺激的方法观察大鼠EP对PPN神经元放电的影响，以探讨GP-PPN通路对PPN神经元活动的影响。
1资料与方法
1.1材料实验选用成年SD雄性大鼠10只，体重250-300g，由漯河医专科实验动物中心提供。
1.2方法
1.2.1动物手术及电刺激大鼠以20%氨基甲酸乙酯0.8ml/100g腹腔麻醉，固定在脑立体定位仪上，行常规开颅术及脑立体定位术，并维持正常体温，保持呼吸道通畅。将刺激电极（NEX100同心圆电极，外径0.25mm，直流阻抗3-6M8）插入脑内EP（坐标为AP-2.3mm，LR2.6mm，H7.4mm），为避免刺激电极与记录电极发生冲撞，将刺激电极由左向右倾斜16b，以观察不同刺激频率对PPN神经元的放电活动的影响。电刺激采用A320R隔离刺激器（美国WPI公司）输出。刺激参数为：单脉冲，强度0.6mA，波宽0.06ms，刺激时程5s，刺激频率分别为5、10、20、50、100、150、200Hz。
1.2.2细胞外记录PPN神经元放电采用自制的单管玻璃微电极进行细胞外記录。借助微电极推进器将微电极缓缓插入PPN（AP-7.3-8.0mm，LR1.5-1.8mm，H6.0-6.5mm）。神经元单位放电经微电极放大器采集、滤波并显示于示波器上，输入计算机处理，再现原始波形，同时生成序列密度直方图。实验过程中只对放电幅度稳定且信噪比>3/1的神经元放电信号进行记录。
1.2.3组织学检测每次实验结束后，玻璃微电极通以（-20LA，20min）电流，将滂胺天蓝泳入，以标记记录部位，刺激部位采用直流电毁损法标记。然后用生理盐水和含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液各50ml经颈动脉灌流行前固定15-20min，迅速取出完整的脑组织，放入同样的固定液中进行后固定至少4h，再将脑组织移入30%的蔗糖磷酸缓冲液（pH=7.4）中过夜，沉底后即可行冰冻切片，片厚30Lm，焦油紫染色，光镜下观察进行组织学鉴定。只对刺激和记录部位均正确的数据进行统计学处理。
1.3统计学处理用SPSS18.0统计软件处理数据，神经元的平均放电频率以（χ±s）表示，施加各处理因素前后差异性比较采用配对t检验。
2结果
2.1正常大鼠PPN神经元的自发放电实验共记录了33个PPN神经元自发放电活动，其放电频率在3.6-52.2Hz之间，平均为（15.95±8.56）Hz。PPN神经元表现为三种放电形式：规则放电、不规则放电和爆发式放电。其中多数为规则放电（69.69%），其次是不规则放电（30.43%），爆发式放电所占比例最小（9.09%，3/33）。
2.2不同频率电刺激EP对PPN放电活动的影响共记录了不同频率电刺激EP（5、10、20、50、100、150、200Hz）对33个PPN神经元放电活动的影响。电刺激EP对PPN神经元放电活动的影响表现为放电频率的减少、增多和无明显变化三种形式。低频电刺激（5-10Hz）大鼠EP时，PPN神经元的自发放电无明显变化（P>0.05），随着刺激频率的增加（20-200Hz），使PPN神经元自发放电活动表为抑制数量增加。
3讨论
脑深部电刺激（deep brain stimulation，DBS）的主要靶点有STN等。但这些部位的DBS并不能很好地改善步态障碍、运动不能和姿势异常等症状。而电刺激PPN可改善PD的步态障碍等症状，很可能成为治疗PD新的刺激靶点[1]。但其机制仍不楚。PPN与基底神经节有着密切的联系，尤其是PPN接受黑质网状部（substantia nigra reticular，SNr）和苍白球内侧部globus pallidus internus，GPi）的GABA能抑制性投射纤维和来自STN的Glu能兴奋性投射纤维[2]。两条传入通路活动的平衡是维持PPN正常功能的必要条件。PPN发出的下行投射纤维至脑桥延髓网状结构和脊髓。动物研究表明PPN在运动的起始、加速、减速和终止过程中起重要作用。
实验结果显示，电刺激EP时大多数PPN神经元的自发放电活动受抑制，在100Hz时的抑制作用最强。解剖学研究证实GPi的GABA能神经纤维直接投射到PPN，而微电泳GABA可抑制PPN神经元的放电活动，并具有紧张性作用。依此可推测电刺激EP时，由于GABA释放增多，增加了对PPN的抑制性作用，从而抑制了PPN神经元的活动，使其放电频率降低。电生理实验显示，在6-OHDA损毁黑质DA能神经元后，PPN神经元自发放电频率明显高于正常的大鼠。代谢研究也显示，PD模型鼠和猴PPN的2-脱氧葡萄糖重吸收增加，反映了STN的兴奋性递质和GPi/SNr的抑制性递质在PPN的作用增强。推测PD时，兴奋性和抑制性输入的失衡很可能会导致PPN的活动异常。
抑制PPN神经元可抑制基底神经节的输出，达到改善PD运动障碍的作用。在正常大鼠PPN也可能通过多突触传递，经SNc的间接影响，对STN起抑制性的调节作用[3]。且束旁核有到STN、纹状体和苍白球的兴奋性投射，PPN也可能通过脚桥核-束旁核间接通路来调节STN的活动[4]。实验结果提示PPN神经元的放电活动与STN的Glu能和GPi/SNr的GABA能传入投射的综合作用有着密切的关系。PD时，大鼠PPN神经元放电频率的增多，可能是STN的兴奋性传入作用强于GPi的抑制性传入作用的结果。GPi-PPN传入神经通路活动的改变参与PD的生理过程。
参考文献
[1]Pienaar IS，Elson JL，Racca C，et al.Mitochondrial abnormality associates with type-specific neuronal loss and cell morphology changes in the pedunculopontine nucleus in Parkinson disease[J].Am J Pathol，2013，183（6）：1826-1840.
[2]Peppe A，Pierantozzi M，Baiamonte V，et al.Deep brain stimulation of pedunculopontine tegmental nucleus：role in sleep modulation in advanced Parkinson disease patients：one-year follow-up[J].Sleep，2012，35（12）：1637-1642.
[3]Mazzone P，Insola A，Valeriani M，et al.Uncertainty，misunderstanding and the pedunculopontine nucleus：the exhumation of an already buried dispute[J].Acta Neurochir（Wien）.，2012，154（8）：1527-1529.
[4]Mazzone P，Sposato S，Insola A，et al.A commentary on the lead positioning for deep brain stimulation in the pedunculopontine tegmental nucleus in a patient affected by multiple system atrophy[J].Stereotact Funct Neurosurg，2012，90（2）：130-133.
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.602文章编号：1004-7484（2014）-05-2870-02苍白球（globus pallidus，GP）在大鼠（entopeduncular nucleus，EP）作为基底节重要的输出核团，与（pedunculopontine nucleus，PPN）有着密切的联系。本实验用电刺激的方法观察大鼠EP对PPN神经元放电的影响，以探讨GP-PPN通路对PPN神经元活动的影响。
1资料与方法
1.1材料实验选用成年SD雄性大鼠10只，体重250-300g，由漯河医专科实验动物中心提供。
1.2方法
1.2.1动物手术及电刺激大鼠以20%氨基甲酸乙酯0.8ml/100g腹腔麻醉，固定在脑立体定位仪上，行常规开颅术及脑立体定位术，并维持正常体温，保持呼吸道通畅。将刺激电极（NEX100同心圆电极，外径0.25mm，直流阻抗3-6M8）插入脑内EP（坐标为AP-2.3mm，LR2.6mm，H7.4mm），为避免刺激电极与记录电极发生冲撞，将刺激电极由左向右倾斜16b，以观察不同刺激频率对PPN神经元的放电活动的影响。电刺激采用A320R隔离刺激器（美国WPI公司）输出。刺激参数为：单脉冲，强度0.6mA，波宽0.06ms，刺激时程5s，刺激频率分别为5、10、20、50、100、150、200Hz。
1.2.2细胞外记录PPN神经元放电采用自制的单管玻璃微电极进行细胞外記录。借助微电极推进器将微电极缓缓插入PPN（AP-7.3-8.0mm，LR1.5-1.8mm，H6.0-6.5mm）。神经元单位放电经微电极放大器采集、滤波并显示于示波器上，输入计算机处理，再现原始波形，同时生成序列密度直方图。实验过程中只对放电幅度稳定且信噪比>3/1的神经元放电信号进行记录。
1.2.3组织学检测每次实验结束后，玻璃微电极通以（-20LA，20min）电流，将滂胺天蓝泳入，以标记记录部位，刺激部位采用直流电毁损法标记。然后用生理盐水和含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液各50ml经颈动脉灌流行前固定15-20min，迅速取出完整的脑组织，放入同样的固定液中进行后固定至少4h，再将脑组织移入30%的蔗糖磷酸缓冲液（pH=7.4）中过夜，沉底后即可行冰冻切片，片厚30Lm，焦油紫染色，光镜下观察进行组织学鉴定。只对刺激和记录部位均正确的数据进行统计学处理。
1.3统计学处理用SPSS18.0统计软件处理数据，神经元的平均放电频率以（χ±s）表示，施加各处理因素前后差异性比较采用配对t检验。
2结果
2.1正常大鼠PPN神经元的自发放电实验共记录了33个PPN神经元自发放电活动，其放电频率在3.6-52.2Hz之间，平均为（15.95±8.56）Hz。PPN神经元表现为三种放电形式：规则放电、不规则放电和爆发式放电。其中多数为规则放电（69.69%），其次是不规则放电（30.43%），爆发式放电所占比例最小（9.09%，3/33）。
2.2不同频率电刺激EP对PPN放电活动的影响共记录了不同频率电刺激EP（5、10、20、50、100、150、200Hz）对33个PPN神经元放电活动的影响。电刺激EP对PPN神经元放电活动的影响表现为放电频率的减少、增多和无明显变化三种形式。低频电刺激（5-10Hz）大鼠EP时，PPN神经元的自发放电无明显变化（P>0.05），随着刺激频率的增加（20-200Hz），使PPN神经元自发放电活动表为抑制数量增加。
3讨论
脑深部电刺激（deep brain stimulation，DBS）的主要靶点有STN等。但这些部位的DBS并不能很好地改善步态障碍、运动不能和姿势异常等症状。而电刺激PPN可改善PD的步态障碍等症状，很可能成为治疗PD新的刺激靶点[1]。但其机制仍不楚。PPN与基底神经节有着密切的联系，尤其是PPN接受黑质网状部（substantia nigra reticular，SNr）和苍白球内侧部globus pallidus internus，GPi）的GABA能抑制性投射纤维和来自STN的Glu能兴奋性投射纤维[2]。两条传入通路活动的平衡是维持PPN正常功能的必要条件。PPN发出的下行投射纤维至脑桥延髓网状结构和脊髓。动物研究表明PPN在运动的起始、加速、减速和终止过程中起重要作用。
实验结果显示，电刺激EP时大多数PPN神经元的自发放电活动受抑制，在100Hz时的抑制作用最强。解剖学研究证实GPi的GABA能神经纤维直接投射到PPN，而微电泳GABA可抑制PPN神经元的放电活动，并具有紧张性作用。依此可推测电刺激EP时，由于GABA释放增多，增加了对PPN的抑制性作用，从而抑制了PPN神经元的活动，使其放电频率降低。电生理实验显示，在6-OHDA损毁黑质DA能神经元后，PPN神经元自发放电频率明显高于正常的大鼠。代谢研究也显示，PD模型鼠和猴PPN的2-脱氧葡萄糖重吸收增加，反映了STN的兴奋性递质和GPi/SNr的抑制性递质在PPN的作用增强。推测PD时，兴奋性和抑制性输入的失衡很可能会导致PPN的活动异常。
抑制PPN神经元可抑制基底神经节的输出，达到改善PD运动障碍的作用。在正常大鼠PPN也可能通过多突触传递，经SNc的间接影响，对STN起抑制性的调节作用[3]。且束旁核有到STN、纹状体和苍白球的兴奋性投射，PPN也可能通过脚桥核-束旁核间接通路来调节STN的活动[4]。实验结果提示PPN神经元的放电活动与STN的Glu能和GPi/SNr的GABA能传入投射的综合作用有着密切的关系。PD时，大鼠PPN神经元放电频率的增多，可能是STN的兴奋性传入作用强于GPi的抑制性传入作用的结果。GPi-PPN传入神经通路活动的改变参与PD的生理过程。
参考文献
[1]Pienaar IS，Elson JL，Racca C，et al.Mitochondrial abnormality associates with type-specific neuronal loss and cell morphology changes in the pedunculopontine nucleus in Parkinson disease[J].Am J Pathol，2013，183（6）：1826-1840.
[2]Peppe A，Pierantozzi M，Baiamonte V，et al.Deep brain stimulation of pedunculopontine tegmental nucleus：role in sleep modulation in advanced Parkinson disease patients：one-year follow-up[J].Sleep，2012，35（12）：1637-1642.
[3]Mazzone P，Insola A，Valeriani M，et al.Uncertainty，misunderstanding and the pedunculopontine nucleus：the exhumation of an already buried dispute[J].Acta Neurochir（Wien）.，2012，154（8）：1527-1529.
[4]Mazzone P，Sposato S，Insola A，et al.A commentary on the lead positioning for deep brain stimulation in the pedunculopontine tegmental nucleus in a patient affected by multiple system atrophy[J].Stereotact Funct Neurosurg，2012，90（2）：130-133.