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摘要： 对天津武清区杨树锈病病原菌进行形态学和分子技术鉴定。结果表明，该菌为落叶松杨栅锈菌（Melampsora larici-populina），其夏孢子黄色，长椭圆形或矩圆形，大小（29.0～44.0） μm×（11.8～24.8）μm，平均大小35.2 μm×18.4 μm（n=50）；基部刺细密较大，顶部刺稀疏较小；夏孢子萌发可生成多个芽管；rDNA-ITS序列长度为663 bp。
关键词：落叶松杨栅锈菌（Melampsora larici-populina）；夏孢子；形态学观察；分子鉴定
中图分类号：S432.4+4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）03-0049-03
Morphological and Molecular Identification of A Poplar Rusts Pathogen
Bai Penghua1，Feng Youren1，Liu Baosheng1*，Zhang Huichao2
（1.Tianjin Institute of Plant Protection，Tianjin 300381，China；
2.Jixian Station of Plant Diseases and Pests Prevention，Tianjin 301900，China）
AbstractBy the methods of morphology and molecule，the poplar rust pathogen in Wuqing district of Tianjin was classified as Melampsora larici-populina. The uredospores were yellow and oblong or rounded rectangle，the size was （29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，mean size was 35.2 um×18.4 μm（n=50）. The thorn on the bottom of the uredospore was bigger and dense，while on the top was smaller and sparse. The uredospore could germinate several tubes；the rDNA-ITS sequence of Melampsora larici-populina was 663bp.
Key wordsMelampsora larici-populina；Uredospore；Morphological observation；Molecule identification
杨树因其生长迅速、适应性强、品种多样、分布广泛且易于繁育等特性，现已成为主要的工业用材树种之一[1，2]。但大规模集约经营的杨树人工林易受病害爆发的威胁，其中由栅锈菌属（Melampsora spp.）引起的叶锈病是杨树生产中的主要病害，阻碍杨树产业发展。
锈菌是一种专性寄生性真菌，病菌夏孢子阶段，可随气流远距离传播，侵染时间长，可重复侵染杨树叶片[3，4]。锈病一般在夏初发生，到8月末9月初就能造成落叶，严重时能导致未成熟芽早落，或使树木易受其它病原物侵染，或易受寒害影响。栅锈菌主要为害叶片，前期夏孢子堆多生叶背面，后期密布叶片，呈黄色粉层，晚秋叶片上出现圆形的棕色至褐色的冬孢子堆[2，5]。本研究旨在通过形态学和分子技术鉴定来自天津武清区的杨树叶片锈病病菌种类，为杨树锈病病菌分子鉴定提供技术支持，并为该病害的防治提供参考。
1材料与方法
1.1供试菌
2014年9月，在天津市现代农业科技创新（武清区）基地，采集带有锈菌夏孢子的新鲜杨树病叶带回实验室，观察锈病症状，备用。
1.2形态学观察
用灭菌洁净小毛笔将夏孢子均匀抖落于滴有灭菌蒸馏水的载玻片上，在普通光学显微镜下，观察夏孢子的形态、颜色，测量夏孢子大小。将新鲜的孢子抖落在含有0.1%葡萄糖液滴的载玻片上，放置于20℃温箱中光照培养，15 h后观察孢子萌发情况。
1.3分子鉴定
1.3.1夏孢子DNA提取采用Lysis缓冲液提取夏孢子DNA，用灭菌载玻片刮取新鲜夏孢子堆于灭菌研钵中，称取20 mg孢子堆，置于1.5 mL离心管内（已加入0.65 mL的 Lysis buffer），震荡30 s再离心2 min（16 875 rcf），将0.5 mL上清液移入新离心管中（内含100 μL乙酸甲缓冲液），将该离心管反复倒置混匀，再离心2 min（16 875 rcf），将0.5 mL上清液移入新离心管中（内含0.5 mL异丙醇），去除上清液加0.75 mL的70%乙醇清洗DNA，离心30 s，去除乙醇，干燥DNA，后将DNA溶解于50 μL水中。
1.3.2rDNA-ITS 序列PCR扩增及扩增产物电泳检测以夏孢子DNA为模板，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′）和ITS4（5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′）对病原菌的rDNA-ITS序列进行PCR扩增。取PCR产物2 μL，以1%琼脂糖凝胶电泳检测后，根据条带亮度粗略估计DNA浓度，同时判别RNA和蛋白质是否除尽。
1.3.3rDNA—ITS序列测序及同源性比对以夏孢子的ITS1和ITS4区扩增产物进行全序列测定[金唯智生物科技（北京）有限公司]，并将获得的DNA序列在NCBI上进行比对。
2结果与分析
2.1形态学鉴定 夏孢子堆主要生在叶背面，布满整个叶面，散生或聚生，粉状，鲜黄色，近圆形；夏孢子黄色，长椭圆形或矩圆形，（29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，平均大小为35.2 μm×18.4 μm（n=50），基部刺细密较大，顶部刺稀疏较小（如图1-a）。夏孢子萌发可生成多个芽管（图1-b）。产生有隔菌丝（图1-c），菌丝分枝（图1-d），并且在叶面形成白色菌丝层。
2.2夏孢子总DNA提取与rDNA-ITS序列PCR扩增
以所提DNA为模板，ITS1和ITS4为引物进行扩增，可扩增出目标条带，目标条带大小为663 bp，见图2。将rDNA-ITS序列PCR产物进行测序，所得结果在NCBI上进行Blast，结果显示与Melampsora larici-populina序列同源性为99%。
3结论与讨论
栅锈菌属是杨树的重要病原菌之一，种类多，种间差异不明显。传统的分类方法是根据夏孢子、冬孢子形态及转主寄主来区分，由于有的菌种没有或很难发现转主寄主，有些菌种生活史没有冬孢子阶段，因此，传统的分类方法有很多不确定因素[7]。本试验结合锈菌夏孢子形态特征及分子生物学技术，准确鉴定了天津武清区杨树锈病病原菌种类为落叶松杨栅锈菌（Melamp-sora larici-populina）。其夏孢子黄色，长椭圆形或矩圆形，大小（29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，平均大小35.2 μm×18.4 μm（n=50），基部刺细密较大，顶部刺稀疏较小；夏孢子萌发可生成多个芽管；rDNA-ITS序列长度为663 bp。
由于植物病原锈菌很难在培养基上进行人工培养，在实验室靠寄主扩繁锈菌夏孢子不仅复杂费时，而且收集的夏孢子数量有限，直接影响锈菌分子鉴定能否顺利完成。因而，寻找快速简易提取锈菌总DNA的技术非常重要。本研究采用Lysis缓冲液提取夏孢子DNA，既简便，又减少了对夏孢子数量的过多依赖，并且成功率高，可直接用于rDNA-ITS序列PCR扩增，可为杨树锈病的病菌分子鉴定提供了一种快速、高效提取锈菌DNA的方法。
参考文献：
[1]Hansen E A. Poplar woody biomass yields： a look to the future[J].Biomass and Bioenergy， 1991，1：1-7.
[2]Heilman P E， Ekuan G， Fogle D. Above-and below-ground biomass and fine roots of 4-year-old hybrids of Populus trichocarpa × Populus deltoids and parental species in short-rotation culture[J].Canadian Journal of Forest Research， 1994， 24（ 6） ： 1186-1192.
[3]郝俊贞. 呼和浩特市青杨叶锈病侵染循环和发病规律的研究[J]. 内蒙古林学院学报， 1990（2） ： 20- 27.
[4]景耀， 杨俊秀， 王培新. 杨树病害[M]. 西安： 陕西科学技术出版社， 1988：34.
[5]周仲铭. 林木病理学 [M].北京：农业出版社，1979：83-87.
[6]余仲东，曹支敏，张星耀.真菌核糖体基因间隔区研究概况[J].西北林学院学报，2000，15（2）：107.
[7]万志兵，管宏伟，张新叶， 等.杨树锈菌种和生理小种鉴别方法评述[J].林业科技开发，2012，26（6）：9-12.
关键词：落叶松杨栅锈菌（Melampsora larici-populina）；夏孢子；形态学观察；分子鉴定
中图分类号：S432.4+4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）03-0049-03
Morphological and Molecular Identification of A Poplar Rusts Pathogen
Bai Penghua1，Feng Youren1，Liu Baosheng1*，Zhang Huichao2
（1.Tianjin Institute of Plant Protection，Tianjin 300381，China；
2.Jixian Station of Plant Diseases and Pests Prevention，Tianjin 301900，China）
AbstractBy the methods of morphology and molecule，the poplar rust pathogen in Wuqing district of Tianjin was classified as Melampsora larici-populina. The uredospores were yellow and oblong or rounded rectangle，the size was （29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，mean size was 35.2 um×18.4 μm（n=50）. The thorn on the bottom of the uredospore was bigger and dense，while on the top was smaller and sparse. The uredospore could germinate several tubes；the rDNA-ITS sequence of Melampsora larici-populina was 663bp.
Key wordsMelampsora larici-populina；Uredospore；Morphological observation；Molecule identification
杨树因其生长迅速、适应性强、品种多样、分布广泛且易于繁育等特性，现已成为主要的工业用材树种之一[1，2]。但大规模集约经营的杨树人工林易受病害爆发的威胁，其中由栅锈菌属（Melampsora spp.）引起的叶锈病是杨树生产中的主要病害，阻碍杨树产业发展。
锈菌是一种专性寄生性真菌，病菌夏孢子阶段，可随气流远距离传播，侵染时间长，可重复侵染杨树叶片[3，4]。锈病一般在夏初发生，到8月末9月初就能造成落叶，严重时能导致未成熟芽早落，或使树木易受其它病原物侵染，或易受寒害影响。栅锈菌主要为害叶片，前期夏孢子堆多生叶背面，后期密布叶片，呈黄色粉层，晚秋叶片上出现圆形的棕色至褐色的冬孢子堆[2，5]。本研究旨在通过形态学和分子技术鉴定来自天津武清区的杨树叶片锈病病菌种类，为杨树锈病病菌分子鉴定提供技术支持，并为该病害的防治提供参考。
1材料与方法
1.1供试菌
2014年9月，在天津市现代农业科技创新（武清区）基地，采集带有锈菌夏孢子的新鲜杨树病叶带回实验室，观察锈病症状，备用。
1.2形态学观察
用灭菌洁净小毛笔将夏孢子均匀抖落于滴有灭菌蒸馏水的载玻片上，在普通光学显微镜下，观察夏孢子的形态、颜色，测量夏孢子大小。将新鲜的孢子抖落在含有0.1%葡萄糖液滴的载玻片上，放置于20℃温箱中光照培养，15 h后观察孢子萌发情况。
1.3分子鉴定
1.3.1夏孢子DNA提取采用Lysis缓冲液提取夏孢子DNA，用灭菌载玻片刮取新鲜夏孢子堆于灭菌研钵中，称取20 mg孢子堆，置于1.5 mL离心管内（已加入0.65 mL的 Lysis buffer），震荡30 s再离心2 min（16 875 rcf），将0.5 mL上清液移入新离心管中（内含100 μL乙酸甲缓冲液），将该离心管反复倒置混匀，再离心2 min（16 875 rcf），将0.5 mL上清液移入新离心管中（内含0.5 mL异丙醇），去除上清液加0.75 mL的70%乙醇清洗DNA，离心30 s，去除乙醇，干燥DNA，后将DNA溶解于50 μL水中。
1.3.2rDNA-ITS 序列PCR扩增及扩增产物电泳检测以夏孢子DNA为模板，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′）和ITS4（5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′）对病原菌的rDNA-ITS序列进行PCR扩增。取PCR产物2 μL，以1%琼脂糖凝胶电泳检测后，根据条带亮度粗略估计DNA浓度，同时判别RNA和蛋白质是否除尽。
1.3.3rDNA—ITS序列测序及同源性比对以夏孢子的ITS1和ITS4区扩增产物进行全序列测定[金唯智生物科技（北京）有限公司]，并将获得的DNA序列在NCBI上进行比对。
2结果与分析
2.1形态学鉴定 夏孢子堆主要生在叶背面，布满整个叶面，散生或聚生，粉状，鲜黄色，近圆形；夏孢子黄色，长椭圆形或矩圆形，（29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，平均大小为35.2 μm×18.4 μm（n=50），基部刺细密较大，顶部刺稀疏较小（如图1-a）。夏孢子萌发可生成多个芽管（图1-b）。产生有隔菌丝（图1-c），菌丝分枝（图1-d），并且在叶面形成白色菌丝层。
2.2夏孢子总DNA提取与rDNA-ITS序列PCR扩增
以所提DNA为模板，ITS1和ITS4为引物进行扩增，可扩增出目标条带，目标条带大小为663 bp，见图2。将rDNA-ITS序列PCR产物进行测序，所得结果在NCBI上进行Blast，结果显示与Melampsora larici-populina序列同源性为99%。
3结论与讨论
栅锈菌属是杨树的重要病原菌之一，种类多，种间差异不明显。传统的分类方法是根据夏孢子、冬孢子形态及转主寄主来区分，由于有的菌种没有或很难发现转主寄主，有些菌种生活史没有冬孢子阶段，因此，传统的分类方法有很多不确定因素[7]。本试验结合锈菌夏孢子形态特征及分子生物学技术，准确鉴定了天津武清区杨树锈病病原菌种类为落叶松杨栅锈菌（Melamp-sora larici-populina）。其夏孢子黄色，长椭圆形或矩圆形，大小（29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，平均大小35.2 μm×18.4 μm（n=50），基部刺细密较大，顶部刺稀疏较小；夏孢子萌发可生成多个芽管；rDNA-ITS序列长度为663 bp。
由于植物病原锈菌很难在培养基上进行人工培养，在实验室靠寄主扩繁锈菌夏孢子不仅复杂费时，而且收集的夏孢子数量有限，直接影响锈菌分子鉴定能否顺利完成。因而，寻找快速简易提取锈菌总DNA的技术非常重要。本研究采用Lysis缓冲液提取夏孢子DNA，既简便，又减少了对夏孢子数量的过多依赖，并且成功率高，可直接用于rDNA-ITS序列PCR扩增，可为杨树锈病的病菌分子鉴定提供了一种快速、高效提取锈菌DNA的方法。
参考文献：
[1]Hansen E A. Poplar woody biomass yields： a look to the future[J].Biomass and Bioenergy， 1991，1：1-7.
[2]Heilman P E， Ekuan G， Fogle D. Above-and below-ground biomass and fine roots of 4-year-old hybrids of Populus trichocarpa × Populus deltoids and parental species in short-rotation culture[J].Canadian Journal of Forest Research， 1994， 24（ 6） ： 1186-1192.
[3]郝俊贞. 呼和浩特市青杨叶锈病侵染循环和发病规律的研究[J]. 内蒙古林学院学报， 1990（2） ： 20- 27.
[4]景耀， 杨俊秀， 王培新. 杨树病害[M]. 西安： 陕西科学技术出版社， 1988：34.
[5]周仲铭. 林木病理学 [M].北京：农业出版社，1979：83-87.
[6]余仲东，曹支敏，张星耀.真菌核糖体基因间隔区研究概况[J].西北林学院学报，2000，15（2）：107.
[7]万志兵，管宏伟，张新叶， 等.杨树锈菌种和生理小种鉴别方法评述[J].林业科技开发，2012，26（6）：9-12.