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摘要 [目的]研究安徽省辣椒疫霉（Phytophthora capsici Leonian）的致病力与多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的关系。[方法]采用平板法定性检测辣椒疫霉产生的果胶酶活性，并对不同致病力菌株的PG活性的变化进行分析。[结果]辣椒疫霉均可产生果胶酶，形成水解圈。供试菌株接种辣椒苗复壮后的PG活性高于复壮前；强致病力菌株的PG活性明显高于弱致病力菌株；供试菌株的PG活性均在培养后第7天达到峰值。[结论]PG活性的高低与辣椒疫霉菌致病力的强弱相关，是该菌的致病相关酶。
关键词 辣椒疫霉；多聚半乳糖醛酸酶；致病力
中图分类号 S436.418.1+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-111-03
由辣椒疫霉引起的辣椒疫病是一种世界毁灭性病害[1]，现该病广泛分布于北京、上海、湖南、安徽、甘肃、新疆、陕西、青海、内蒙古、辽宁、吉林、山东、云南、台湾、湖北、海南等地，尤以江苏、浙江、安徽、上海等长江中下游地区发生严重[2-6]，已成为我国辣椒生产的严重障碍[7]。
植物病原真菌病菌分泌的酶主要包括几种果胶降解酶，如果胶甲基酯酶（PME）、果胶裂解酶（PL）和PG[8-9]。关于果胶酶对真菌致病性中的作用已有报道[10]，人们对果胶酶对病原真菌的作用的相关研究进行了总结，但迄今的数据几乎只认定致病性是数量性状[11-12]。而Have等[11]还认为真菌细胞壁降解酶在致病性上的作用与真菌的生活史相关。Reignault等[13]认为果胶酶不但能决定植物被入侵的程度，而且可以决定病害症状的特征。人们调查了大量病害的植物病原菌果胶酶与致病性的相关性，得到了很大进展，但关于辣椒疫霉致病性与果胶酶的相关性研究很少。
PG是一种细胞壁结合蛋白，催化裂解果胶分子聚半乳糖醛酸，降解果胶，使细胞壁结构解体，从而导致果实的软化。PG不仅与果实成熟、叶和花的脱落、豆荚开裂、花粉成熟、病原物防御以及植物寄主的互作有关，还与细胞伸长、发育和木质化有关。病原菌侵染寄主植物时首先分泌的细胞壁降解酶是PG，因此，PG的研究受到了广泛关注并取得了一定的成果。研究发现PG是许多植物病原卵菌的关键致病因子，在病原菌与寄主的相互作用中起重要作用[14]。孙文秀[15]从蛋白水平上研究了大豆疫霉根腐病菌的PG活性对致病力的影响，结果表明，该菌能分泌PG，大豆疫霉根腐病菌的PG活性高低与致病力强弱有一定的相关性。笔者在前期试验的基础上，研究了PG活性对辣椒疫霉致病性的影响，旨在为进一步从分子水平上探讨辣椒疫霉菌的致病遗传机制和防治辣椒疫病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株。
56个辣椒疫霉菌株用于果胶酶定性测定；选取强致病性菌株FY2、FY2′（将菌株FY2接种辣椒苗复壮后重新分离获得）和弱致病性菌株HX2用于PG活性的测定。
1.1.2 培养基。
胡萝卜培养基（CA）：将200.00 g新鲜胡萝卜切成小片，加去离子水500.0 ml，煮沸后计时30 min，用双层纱布过滤去渣，补水至1 000.0 ml，加入琼脂20.00 g，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
Czapek-Dox固体培养基：KNO3 2.00 g，KCl 0.50 g，FeSO4 0.01 g，K2HPO4 1.00 g，MgSO4 0.50 g，维生素B1 0.20 g，L-天冬酰胺0.50 g，柑橘果胶10.00 g，琼脂粉20.00 g，蒸馏水1 000.0 ml。
Czapek-Dox液体培养基：KNO3 2.00 g，KCl 0.50 g，FeSO4 0.01 g，K2HPO4 1.00 g，MgSO4 0.50 g，维生素B1 0.20 g，L-天冬酰胺0.50 g，柑橘果胶10.00 g，蒸馏水1 000.0 ml。
1.2 方法
1.2.1 果胶酶定性测定。
辣椒疫霉菌株在CA平板上25 ℃、黑暗中生长3 d后，用打孔器沿菌落边缘打直径为7 mm的菌碟，接种于初筛培养基中，28 ℃培养2 d后，加入2.0 ml 0.2%刚果红染色液，静止染色10 min，然后倒出染色液，加生理盐水漂洗。对于有水解圈现象的平板，测量水解圈直径（D）和菌落直径（d），并计算D/d值。通过比较D/d值来判断菌株的产果胶酶的能力。
1.2.2 辣椒疫霉PG粗酶液的制备。
将在CA培养基上培养3 d的辣椒疫霉菌株接到Czapek-Dox液体培养基中，每瓶5个菌碟，每个菌株各培养3瓶，28 ℃下100 r/min振荡培养。每隔24 h取样一次，每次每瓶吸取1 ml，连续取样14 d，样品在4 ℃下5 000 r/min离心30 min，取上清液供PG活性测定。
1.2.3 辣椒疫霉PG活性的测定。
采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法。将1.00 g DNS溶于20.0 ml 1.00 mol/L氢氧化钠溶液中，加入50.0 ml蒸馏水、30.00 g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水稀释至100.0 ml，密封。取1.8 ml 0.1%多聚半乳糖醛酸溶液，加100 μl酶液、100 μl 0.05 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，30 ℃水浴1 h。反应后取0.2 ml反应液与0.2 ml DNS试剂混合，沸水浴10 min。然后取出用双蒸水稀释至3.0 ml，用分光光度计测定OD540，以煮沸的培养基滤液作为对照。PG酶活力单位定义为：在上述条件下，1 min酶液分解果胶生成1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活单位（U）。
2 结果与分析
2.1 强致病力和弱致病力辣椒疫霉菌产果胶酶的比较 在Czapek-Dox固体培养基上，培养2 d的辣椒疫霉菌用刚果红染色，生理盐水漂洗后，产果胶酶的菌株会有明显的水解圈（图1）。结果表明，所有供试的辣椒疫霉菌株均能产生果胶酶，各个菌株形成水解圈的直径不同，其中，菌株FY2′经刚果红染色后的水解圈直径最大，达56.3 mm（表1）。1.10≤D/d≤1.50的菌株共26个，占 总菌株数的46.4%；1.51≤D/d≤2.00的菌株共28个，占总菌株数的50.0%；2.01≤D/d≤2.15的菌株共2个，占总菌株数的3.6%。水解圈直径和菌落直径的比值反映各菌株产果胶酶能力的大小，比值越大，产果胶酶的能力越强。与前期的致病力测定结果比较，发现产酶能力的大小与菌株的致病力存在一定的相关性，菌株HX2对辣椒对致病力较弱，产生的水解圈不明显；菌株FY2的致病力较强，产生了明显的水解圈，且菌株FY2′的致病力强于FY2。部分菌株虽然致病力弱，但形成了明显的水解圈，可能原因是产生的果胶酶不是主要作用于PG。选取致病力强且水解圈明显的菌株FY2、复壮后的菌株FY2′以及致病力弱且水解圈不明显的菌株HX2，测定PG的活性。
2.2 辣椒疫霉不同致病性菌株的PG活性大小
2.2.1 辣椒疫霉致病菌株接种前后PG活性的比较。
测定菌株FY2以及FY2接种辣椒重新分离得到的菌株FY2′的PG活性。由图2可知，供试菌株在含柑橘果胶的液体培养基中培养，均产生较高的胞外PG活性。其中，FY2′的PG活性高于FY2，且均在第7天达到最高值，表明辣椒疫霉菌株接种复壮前后的PG活性存在差异，复壮后菌株PG活性高于复壮前菌株，表明PG与辣椒疫霉的致病力存在一定的相关性。
2.2.2 辣椒疫霉强致病性菌株和弱致病性菌株PG活性的比较。
由图3可知，2种菌株均能分泌胞外PG，且强致病性菌株的PG活性高于弱致病性菌株，并同时于第7天达到酶活高峰。因此，PG是辣椒疫霉菌与致病力相关的一种细胞壁降解酶。
3 讨论
植物病原菌侵染寄主植物是一个复杂过程，在侵入过程中首先遇到表皮角质层的障碍，然后遇到细胞壁屏障。因此，寄主与病原物建立寄生关系时，病原菌分泌的酶可以分解寄主的角质层和细胞壁等，使植物发病。其中，果胶酶是主要的细胞壁降解酶，作用于细胞壁的中胶层。而PG是果胶水解酶之一，多数病原物与寄主互作过程中都会产生一定量的PG，导致细胞壁结构解体和组织软化。由于病原菌侵染寄主植物首先分泌的细胞壁降解酶为PG，因此，PG的研究已受到广泛关注。
国外已有关于疫霉pg基因簇的研究报道，并发现多聚半乳糖醛酸酶是许多卵菌的致病关键因子[16]。Torto等[17]从马铃薯晚疫病菌（P.infestans）分离得到卵菌的第1个endo-PG 基因pipg1，为卵菌的进化研究迈出了关键的一步，研究发现该基因在P.infestans侵染寄主前期和侵染过程中会大量表达；同时，基因pipg1编码的内切多聚半乳糖醛酸酶具有致病活性，且该基因在卵菌的进化中起着重要作用。PG的致病性由单个或多个基因共同调控，当灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的1个内切型PG基因有效表达，会加重番茄果实
发病[18]；当腐皮镰刀菌（Fusarium solani）的1个内切PG基
因受到抑制，致病性就会丧失[19]；隐球丛赤壳菌（Cryphonectria parasitica）的Enpg-1基因发生突变，对致病性无明显影响[20]；链格孢菌（Alternaria citri）的1个内切型PG基因发生突变，会减轻柑橘果实发病[21]。
目前，研究者不断优化培养条件，探索最佳的产酶条件，以便更好地确定防治病害的最佳时机。Maldonado等[22]研究发现，黑曲霉在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中，30 ℃下300 r/min 培养 72 h，结果在24 h时PG活性达到最高，并且该菌在固体和液体培养基上均能产生PG，该酶的活性与葡萄糖浓度成反比。Charlone等[23]研究发现Ca2+浓度对灰葡萄孢所分泌的2种PG的活性都能产生部分的抑制作用。该研究从蛋白质水平上研究了辣椒疫霉的PG活性对致病力的影响，结果表明辣椒疫霉能够分泌PG，PG活性随病菌培养时间的增加酶活性增加，在第7天达最高值，之后酶活性呈下降趋势。证实了PG是该菌的与致病作用相关的细胞壁降解酶，初步阐明了辣椒疫霉菌致病机理。为更好地防治辣椒疫病，明确辣椒疫霉菌PG致病的分子机制，还有待于从基因水平对关键致病基因进行进一步探索。
参考文献
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关键词 辣椒疫霉；多聚半乳糖醛酸酶；致病力
中图分类号 S436.418.1+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-111-03
由辣椒疫霉引起的辣椒疫病是一种世界毁灭性病害[1]，现该病广泛分布于北京、上海、湖南、安徽、甘肃、新疆、陕西、青海、内蒙古、辽宁、吉林、山东、云南、台湾、湖北、海南等地，尤以江苏、浙江、安徽、上海等长江中下游地区发生严重[2-6]，已成为我国辣椒生产的严重障碍[7]。
植物病原真菌病菌分泌的酶主要包括几种果胶降解酶，如果胶甲基酯酶（PME）、果胶裂解酶（PL）和PG[8-9]。关于果胶酶对真菌致病性中的作用已有报道[10]，人们对果胶酶对病原真菌的作用的相关研究进行了总结，但迄今的数据几乎只认定致病性是数量性状[11-12]。而Have等[11]还认为真菌细胞壁降解酶在致病性上的作用与真菌的生活史相关。Reignault等[13]认为果胶酶不但能决定植物被入侵的程度，而且可以决定病害症状的特征。人们调查了大量病害的植物病原菌果胶酶与致病性的相关性，得到了很大进展，但关于辣椒疫霉致病性与果胶酶的相关性研究很少。
PG是一种细胞壁结合蛋白，催化裂解果胶分子聚半乳糖醛酸，降解果胶，使细胞壁结构解体，从而导致果实的软化。PG不仅与果实成熟、叶和花的脱落、豆荚开裂、花粉成熟、病原物防御以及植物寄主的互作有关，还与细胞伸长、发育和木质化有关。病原菌侵染寄主植物时首先分泌的细胞壁降解酶是PG，因此，PG的研究受到了广泛关注并取得了一定的成果。研究发现PG是许多植物病原卵菌的关键致病因子，在病原菌与寄主的相互作用中起重要作用[14]。孙文秀[15]从蛋白水平上研究了大豆疫霉根腐病菌的PG活性对致病力的影响，结果表明，该菌能分泌PG，大豆疫霉根腐病菌的PG活性高低与致病力强弱有一定的相关性。笔者在前期试验的基础上，研究了PG活性对辣椒疫霉致病性的影响，旨在为进一步从分子水平上探讨辣椒疫霉菌的致病遗传机制和防治辣椒疫病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株。
56个辣椒疫霉菌株用于果胶酶定性测定；选取强致病性菌株FY2、FY2′（将菌株FY2接种辣椒苗复壮后重新分离获得）和弱致病性菌株HX2用于PG活性的测定。
1.1.2 培养基。
胡萝卜培养基（CA）：将200.00 g新鲜胡萝卜切成小片，加去离子水500.0 ml，煮沸后计时30 min，用双层纱布过滤去渣，补水至1 000.0 ml，加入琼脂20.00 g，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
Czapek-Dox固体培养基：KNO3 2.00 g，KCl 0.50 g，FeSO4 0.01 g，K2HPO4 1.00 g，MgSO4 0.50 g，维生素B1 0.20 g，L-天冬酰胺0.50 g，柑橘果胶10.00 g，琼脂粉20.00 g，蒸馏水1 000.0 ml。
Czapek-Dox液体培养基：KNO3 2.00 g，KCl 0.50 g，FeSO4 0.01 g，K2HPO4 1.00 g，MgSO4 0.50 g，维生素B1 0.20 g，L-天冬酰胺0.50 g，柑橘果胶10.00 g，蒸馏水1 000.0 ml。
1.2 方法
1.2.1 果胶酶定性测定。
辣椒疫霉菌株在CA平板上25 ℃、黑暗中生长3 d后，用打孔器沿菌落边缘打直径为7 mm的菌碟，接种于初筛培养基中，28 ℃培养2 d后，加入2.0 ml 0.2%刚果红染色液，静止染色10 min，然后倒出染色液，加生理盐水漂洗。对于有水解圈现象的平板，测量水解圈直径（D）和菌落直径（d），并计算D/d值。通过比较D/d值来判断菌株的产果胶酶的能力。
1.2.2 辣椒疫霉PG粗酶液的制备。
将在CA培养基上培养3 d的辣椒疫霉菌株接到Czapek-Dox液体培养基中，每瓶5个菌碟，每个菌株各培养3瓶，28 ℃下100 r/min振荡培养。每隔24 h取样一次，每次每瓶吸取1 ml，连续取样14 d，样品在4 ℃下5 000 r/min离心30 min，取上清液供PG活性测定。
1.2.3 辣椒疫霉PG活性的测定。
采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法。将1.00 g DNS溶于20.0 ml 1.00 mol/L氢氧化钠溶液中，加入50.0 ml蒸馏水、30.00 g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水稀释至100.0 ml，密封。取1.8 ml 0.1%多聚半乳糖醛酸溶液，加100 μl酶液、100 μl 0.05 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，30 ℃水浴1 h。反应后取0.2 ml反应液与0.2 ml DNS试剂混合，沸水浴10 min。然后取出用双蒸水稀释至3.0 ml，用分光光度计测定OD540，以煮沸的培养基滤液作为对照。PG酶活力单位定义为：在上述条件下，1 min酶液分解果胶生成1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活单位（U）。
2 结果与分析
2.1 强致病力和弱致病力辣椒疫霉菌产果胶酶的比较 在Czapek-Dox固体培养基上，培养2 d的辣椒疫霉菌用刚果红染色，生理盐水漂洗后，产果胶酶的菌株会有明显的水解圈（图1）。结果表明，所有供试的辣椒疫霉菌株均能产生果胶酶，各个菌株形成水解圈的直径不同，其中，菌株FY2′经刚果红染色后的水解圈直径最大，达56.3 mm（表1）。1.10≤D/d≤1.50的菌株共26个，占 总菌株数的46.4%；1.51≤D/d≤2.00的菌株共28个，占总菌株数的50.0%；2.01≤D/d≤2.15的菌株共2个，占总菌株数的3.6%。水解圈直径和菌落直径的比值反映各菌株产果胶酶能力的大小，比值越大，产果胶酶的能力越强。与前期的致病力测定结果比较，发现产酶能力的大小与菌株的致病力存在一定的相关性，菌株HX2对辣椒对致病力较弱，产生的水解圈不明显；菌株FY2的致病力较强，产生了明显的水解圈，且菌株FY2′的致病力强于FY2。部分菌株虽然致病力弱，但形成了明显的水解圈，可能原因是产生的果胶酶不是主要作用于PG。选取致病力强且水解圈明显的菌株FY2、复壮后的菌株FY2′以及致病力弱且水解圈不明显的菌株HX2，测定PG的活性。
2.2 辣椒疫霉不同致病性菌株的PG活性大小
2.2.1 辣椒疫霉致病菌株接种前后PG活性的比较。
测定菌株FY2以及FY2接种辣椒重新分离得到的菌株FY2′的PG活性。由图2可知，供试菌株在含柑橘果胶的液体培养基中培养，均产生较高的胞外PG活性。其中，FY2′的PG活性高于FY2，且均在第7天达到最高值，表明辣椒疫霉菌株接种复壮前后的PG活性存在差异，复壮后菌株PG活性高于复壮前菌株，表明PG与辣椒疫霉的致病力存在一定的相关性。
2.2.2 辣椒疫霉强致病性菌株和弱致病性菌株PG活性的比较。
由图3可知，2种菌株均能分泌胞外PG，且强致病性菌株的PG活性高于弱致病性菌株，并同时于第7天达到酶活高峰。因此，PG是辣椒疫霉菌与致病力相关的一种细胞壁降解酶。
3 讨论
植物病原菌侵染寄主植物是一个复杂过程，在侵入过程中首先遇到表皮角质层的障碍，然后遇到细胞壁屏障。因此，寄主与病原物建立寄生关系时，病原菌分泌的酶可以分解寄主的角质层和细胞壁等，使植物发病。其中，果胶酶是主要的细胞壁降解酶，作用于细胞壁的中胶层。而PG是果胶水解酶之一，多数病原物与寄主互作过程中都会产生一定量的PG，导致细胞壁结构解体和组织软化。由于病原菌侵染寄主植物首先分泌的细胞壁降解酶为PG，因此，PG的研究已受到广泛关注。
国外已有关于疫霉pg基因簇的研究报道，并发现多聚半乳糖醛酸酶是许多卵菌的致病关键因子[16]。Torto等[17]从马铃薯晚疫病菌（P.infestans）分离得到卵菌的第1个endo-PG 基因pipg1，为卵菌的进化研究迈出了关键的一步，研究发现该基因在P.infestans侵染寄主前期和侵染过程中会大量表达；同时，基因pipg1编码的内切多聚半乳糖醛酸酶具有致病活性，且该基因在卵菌的进化中起着重要作用。PG的致病性由单个或多个基因共同调控，当灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的1个内切型PG基因有效表达，会加重番茄果实
发病[18]；当腐皮镰刀菌（Fusarium solani）的1个内切PG基
因受到抑制，致病性就会丧失[19]；隐球丛赤壳菌（Cryphonectria parasitica）的Enpg-1基因发生突变，对致病性无明显影响[20]；链格孢菌（Alternaria citri）的1个内切型PG基因发生突变，会减轻柑橘果实发病[21]。
目前，研究者不断优化培养条件，探索最佳的产酶条件，以便更好地确定防治病害的最佳时机。Maldonado等[22]研究发现，黑曲霉在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中，30 ℃下300 r/min 培养 72 h，结果在24 h时PG活性达到最高，并且该菌在固体和液体培养基上均能产生PG，该酶的活性与葡萄糖浓度成反比。Charlone等[23]研究发现Ca2+浓度对灰葡萄孢所分泌的2种PG的活性都能产生部分的抑制作用。该研究从蛋白质水平上研究了辣椒疫霉的PG活性对致病力的影响，结果表明辣椒疫霉能够分泌PG，PG活性随病菌培养时间的增加酶活性增加，在第7天达最高值，之后酶活性呈下降趋势。证实了PG是该菌的与致病作用相关的细胞壁降解酶，初步阐明了辣椒疫霉菌致病机理。为更好地防治辣椒疫病，明确辣椒疫霉菌PG致病的分子机制，还有待于从基因水平对关键致病基因进行进一步探索。
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