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摘 要 为了解广藿香对淀粉的利用，克隆了广藿香（Pogostemon cablin）的α-淀粉酶（alpha-amylase，AMY）基因，对其进行相关生物信息学分析。搜索本课题组建立的广藿香转录组数据库，获得AMY基因全长序列，并设计全长引物进行PCR验证；利用生物信息学软件对AMY基因进行生物信息学分析。本研究获得的广藿香AMY基因命名为PcAMY1基因（GenBank登录号为KC862311），该基因全长1 420 bp，编码422个氨基酸。基于生物信息软件分析了PcAMY1基因编码蛋白的理化特性。系统进化树分析结果表明，PcAMY1基因与牵牛（Ipomoea nil）的AMY序列同源性最高，与赤豆（Vigna angularis）、菜豆（haseolus vulgaris）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）等植物次之，与自然进化关系保持一致。PcAMY1基因在广藿香嫩茎、成熟茎、老茎、 嫩叶、成熟叶、老叶中均有表达，但在老茎中表达量最高。成功克隆到广藿香PcAMY1基因，并对其进行相关生物信息学与基因表达分析。
关键词 广藿香；α-淀粉酶；PcAMY1基因；基因克隆；生物信息学分析
中图分类号 R282.12 文献标识码 A
Cloning and Analysis of Alpha-amylase（PcAMY1）
Gene in Pogostmen cablin
OUYANG Puyue1， LIU Yongliang2， WANG Ying3， YAN Zhen1 *
1 Guangdong Food and Drug Vocational College， Guangzhou， Guangdong 510520， China
2 Wuhan Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Wuhan， Hubei 430074， China
3 South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou， Guangdong 510650， China
Abstract Objective In order to understand the using process of starch in Pogostemon cablin， an alpha-amylase gene PcAMY1 was cloned and analyzed bioinformatically. Methods The full length AMY gene sequence was retrieved from transcriptomic database of P. cablin， the full length primer was designed for PCR verification， and PcAMY1 gene was analyzed using several bioinformatical softwares. Results PcAMY1（NCBI accession， KC862311）contained1 420 bp length of open reading frame（ORF）and encoded 422 amino acids postulated. Additionally， the physical and chemical properties of PcAMY1-coded protein were analyzed by bioinformatical softwares. Phylogenetic analysis showed that PcAMY1 was tightly clustered with AMY genes in Ipomoea nil， Vigna angularis， and haseolus vulgaris， which is consistent to the phylogenetic relationship of species. The expression level of PcAMY1 was most abundantly in P. cablin old stem， followed by mature leaf， that for other organs was low. Conclusion PcAMY1 is successfully coloned and molecularly characterized. The results would lay a fundamental foundation for P. cablin researches.
Key words Pogostemon cablin（Blanco）Benth； Alpha-amylase； PcAMY1 gene； Gene cloning； Bioinformatical analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.022
植物和光合微生物如蓝藻、真菌等可直接利用光合作用合成淀粉并储存在体内，动物和非光合微生物则只能利用现成的淀粉。淀粉的利用必须具有能催化α-1，4-糖苷键的淀粉酶，即α-amylase（AMY）。从低等的细菌、真菌到高植物体内都含有α-淀粉酶。目前对于α-淀粉酶（AMY）基因的研究已在细菌、真菌、植物、动物中均有报道[1-7]。国内对AMY基因的研究主要集中在动物和菌类植物方面[1-3]。国外对AMY基因的研究，主要集中在淀粉含量高的植物如百合、郁金香、风信子及谷类植物等[4-7]，并进行了AMY基因克隆、表达及分析方面的研究，结果表明，AMY基因在种子萌发、球根作为繁殖器官两方面[8-13]发挥了重要的作用。 广藿香[Pogostemon cablin（Blanco）benth]为唇形科剌蕊草属植物，以全草入药。味辛，性微温，归脾、胃、肺经。广藿香原产于菲律宾、马来西亚、印度等国家，自宋代传入中国已有1000余年历史[14]，是中成药/医药、香料/化妆品等的主要原料。近年来，每年国内市场广藿香挥发油需求量约220 t而年产量仅为40～50 t，出现了严重的供需矛盾。因此，加速推进广藿香萜类物质生物合成的分子机制研究，提高广藿香萜类物质尤其是广藿香醇含量，是当前广藿香研究的重要课题。最新药理药效研究表明，广藿香提取物中的萜类化合物具有杀锥虫[15]、杀螨[16]、抗流感病毒[17]等活性。值得注意的是：植物体内萜类化合物的合成主要前体物质是糖，且糖经过糖酵解途径、以及MEP和/或MVA等途径合成种类繁多的萜类物质[18]。而α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）在淀粉水解过程扮演重要角色，从而有利于其他酶类参与该降解过程，最终将淀粉降解为生物可利用的单糖[19]。由此可见，α-淀粉酶水解淀粉产生单糖是大量合成广藿香萜类物质的关键酶。
鉴于α-淀粉酶在萜类物质合成的重要性，目前广藿香的AMY基因的克隆与蛋白结构和功能方面的研究未见报道。本研究组利用前期研究中获得了大量的广藿香转录组信息，挖掘到一条AMY基因序列；并采用PCR技术克隆广藿香PcAMY1基因全长序列、对其理化性质进行了生物信息学分析；采用RealtimePCR技术对其不同时期不同部位进行了PcAMY1基因表达分析，为丰富广藿香的分子生物学信息奠定了基础，并希望能在后期调控AMY基因，以期为广藿香更深入的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验材料采自于广东食品药品职业学院药用植物标本园广藿香栽培地。选取海南广藿香展开幼叶及成熟黄褐色叶，迅速放入装有液氮的保温瓶中，后置于-75 ℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 总RNA 的提取 取-75 ℃保存的幼叶及成熟叶，在180～200 ℃烘烤过的研钵中用液氮将其充分研磨，迅速倒入DEPC处理过2.3.5 PcAMY1基因不同组织表达分析 实时荧光定量PCR检测到PcAMY1基因在广藿香的嫩茎、成熟茎、老茎、 嫩叶、成熟叶、老叶中均有表达，但老茎中表达量最高（图8）。
3 讨论与结论
本研究成功克隆了广藿香的α-淀粉酶（PcAMY1）基因，其cDNA全长1 420 bp，编码422个氨基酸，并对其测序并进行了相关的生物信息学分析[22]。α-淀粉酶具有水解淀粉产生单糖的功能[18]，而萜类物质是由单糖经过糖酵解、MVA、MEP途径而合成的[19]；因而α-淀粉酶在源头上起到调控着萜类物质代谢流大小的作用。实时定量PCR的结果发现PcAMY1基因在广藿香的嫩茎、成熟茎、老茎、嫩叶、成熟叶、老叶中均有表达说明该基因表达存在普遍性，而叶的3个时期中成熟叶表达最高，成熟叶大，颜色绿，α-淀粉在光合作用中起着非常大的作用；茎的3个时期中老茎表达最高，3种不同时期的茎，嫩茎、成熟茎、老茎相比，老茎的纤维含量最高，成熟茎次之，嫩茎含纤维最少，这说明α-淀粉酶在纤维的形成中可能起着一定的作用。目前在其它物种中尚未有AMY基因的表达研究。
基于AMY基因利用NJ法构建的12个不同物种间的进化树表明PcAMY1基因与牵牛（Ipomoea nil）的AMY序列同源性最高，与赤豆（Vigna angularis）、菜豆（haseolus vulgaris）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）等植物次之。与关系最近的牵牛均为合瓣花，较近的均为双子叶植物，再与较远的为单子叶植物集成一类。这与植物发育进化一致。序列比对和系统发育树分析表明，本研究克隆得到的PcAMY1基因与NCBI数据库中登陆的其他物种的α-淀粉酶基因具有很高的同源性和较近的亲缘关系。广藿香的PcAMY1基因克隆及生物信息学分析研究，旨在丰富广藿香的分子生物学信息奠定基础，并在后期的对AMY基因进行功能剖析，以期为广藿香更深入的研究奠定基础。
参考文献
[1] 廖 芳. 野桑蚕淀粉酶基因的分段克隆， 序列分析及其分子系统学研究[D]. 北碚： 西南农业大学， 2003.
[2] 潘俐玲. 大珠母贝和企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因及α-淀粉酶基因的克隆与表达分析[D]. 上海： 上海海洋大学， 2011.
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[10] Labrechts H， F Rook， C. Kolloffel.Carbohydrate status of tulip bulbs during cold-induced flower stalk elongation and flowering[J]. Plant Physiol， 1994， 104： 515-520
[11] Gubler F P M， Chandler R G， White D J， et al. Gibberellin signaling in barley aleurone cells： Control of SLN1 and GAMYB expression[J]. Plant PHysiol， 2002， 129： 191-200.
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[14] 吴友根， 郭巧生， 郑焕强. 广藿香本草及引种历史考证的研究[J]. 中国中药杂志， 2007， 20： 2 114-2 117.
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[16] Wu H Q， Li L， Li J， et al. caricidal activity of DHEMH， derived from patchouli oil， against house dust mite， Dermatophagoides farinae[J]. Chem Pharm Bull， 2012， 60： 178-182.
[17] Kiyohara H， Ichino C， Kawamura Y， et al. Patchouli alcohol： in vitro direct anti-influenza virus sesquiterpene in Pogostemon cablin Benth[J]. J Natl Med， 2012， 66： 55-61.
[18] Dudareva N， Klempien A， Muhlemann J K， et al. Biosynthesis， function and metabolic engineering of plant volatile organic compounds[J]. New Phytol， 2013， 198： 16-32.
[19] Beck E， Ziegler P. Biosynthes is and degradation of starch in higher plants[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol， 1989， 40： 95-117.
[20] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-[△][△]CT method[J]. Methods 25， 2001： 402-408.
[21] 国家药典委员会， 中华人民共和国药典[M]（一部）. 北京： 中国医药科技出版社， 2010.
[22] Sun Y Z， Niu Y Y， Li Y， et al. Cloning and bioinformatics analysis of PqERF1 gene in Panax quinquefolius[J]. Acta Pharm Sin， 2011， 46： 1 008-1 014.
关键词 广藿香；α-淀粉酶；PcAMY1基因；基因克隆；生物信息学分析
中图分类号 R282.12 文献标识码 A
Cloning and Analysis of Alpha-amylase（PcAMY1）
Gene in Pogostmen cablin
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Abstract Objective In order to understand the using process of starch in Pogostemon cablin， an alpha-amylase gene PcAMY1 was cloned and analyzed bioinformatically. Methods The full length AMY gene sequence was retrieved from transcriptomic database of P. cablin， the full length primer was designed for PCR verification， and PcAMY1 gene was analyzed using several bioinformatical softwares. Results PcAMY1（NCBI accession， KC862311）contained1 420 bp length of open reading frame（ORF）and encoded 422 amino acids postulated. Additionally， the physical and chemical properties of PcAMY1-coded protein were analyzed by bioinformatical softwares. Phylogenetic analysis showed that PcAMY1 was tightly clustered with AMY genes in Ipomoea nil， Vigna angularis， and haseolus vulgaris， which is consistent to the phylogenetic relationship of species. The expression level of PcAMY1 was most abundantly in P. cablin old stem， followed by mature leaf， that for other organs was low. Conclusion PcAMY1 is successfully coloned and molecularly characterized. The results would lay a fundamental foundation for P. cablin researches.
Key words Pogostemon cablin（Blanco）Benth； Alpha-amylase； PcAMY1 gene； Gene cloning； Bioinformatical analysis
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植物和光合微生物如蓝藻、真菌等可直接利用光合作用合成淀粉并储存在体内，动物和非光合微生物则只能利用现成的淀粉。淀粉的利用必须具有能催化α-1，4-糖苷键的淀粉酶，即α-amylase（AMY）。从低等的细菌、真菌到高植物体内都含有α-淀粉酶。目前对于α-淀粉酶（AMY）基因的研究已在细菌、真菌、植物、动物中均有报道[1-7]。国内对AMY基因的研究主要集中在动物和菌类植物方面[1-3]。国外对AMY基因的研究，主要集中在淀粉含量高的植物如百合、郁金香、风信子及谷类植物等[4-7]，并进行了AMY基因克隆、表达及分析方面的研究，结果表明，AMY基因在种子萌发、球根作为繁殖器官两方面[8-13]发挥了重要的作用。 广藿香[Pogostemon cablin（Blanco）benth]为唇形科剌蕊草属植物，以全草入药。味辛，性微温，归脾、胃、肺经。广藿香原产于菲律宾、马来西亚、印度等国家，自宋代传入中国已有1000余年历史[14]，是中成药/医药、香料/化妆品等的主要原料。近年来，每年国内市场广藿香挥发油需求量约220 t而年产量仅为40～50 t，出现了严重的供需矛盾。因此，加速推进广藿香萜类物质生物合成的分子机制研究，提高广藿香萜类物质尤其是广藿香醇含量，是当前广藿香研究的重要课题。最新药理药效研究表明，广藿香提取物中的萜类化合物具有杀锥虫[15]、杀螨[16]、抗流感病毒[17]等活性。值得注意的是：植物体内萜类化合物的合成主要前体物质是糖，且糖经过糖酵解途径、以及MEP和/或MVA等途径合成种类繁多的萜类物质[18]。而α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）在淀粉水解过程扮演重要角色，从而有利于其他酶类参与该降解过程，最终将淀粉降解为生物可利用的单糖[19]。由此可见，α-淀粉酶水解淀粉产生单糖是大量合成广藿香萜类物质的关键酶。
鉴于α-淀粉酶在萜类物质合成的重要性，目前广藿香的AMY基因的克隆与蛋白结构和功能方面的研究未见报道。本研究组利用前期研究中获得了大量的广藿香转录组信息，挖掘到一条AMY基因序列；并采用PCR技术克隆广藿香PcAMY1基因全长序列、对其理化性质进行了生物信息学分析；采用RealtimePCR技术对其不同时期不同部位进行了PcAMY1基因表达分析，为丰富广藿香的分子生物学信息奠定了基础，并希望能在后期调控AMY基因，以期为广藿香更深入的研究奠定基础。
1 材料与方法
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1.2 方法
1.2.1 总RNA 的提取 取-75 ℃保存的幼叶及成熟叶，在180～200 ℃烘烤过的研钵中用液氮将其充分研磨，迅速倒入DEPC处理过2.3.5 PcAMY1基因不同组织表达分析 实时荧光定量PCR检测到PcAMY1基因在广藿香的嫩茎、成熟茎、老茎、 嫩叶、成熟叶、老叶中均有表达，但老茎中表达量最高（图8）。
3 讨论与结论
本研究成功克隆了广藿香的α-淀粉酶（PcAMY1）基因，其cDNA全长1 420 bp，编码422个氨基酸，并对其测序并进行了相关的生物信息学分析[22]。α-淀粉酶具有水解淀粉产生单糖的功能[18]，而萜类物质是由单糖经过糖酵解、MVA、MEP途径而合成的[19]；因而α-淀粉酶在源头上起到调控着萜类物质代谢流大小的作用。实时定量PCR的结果发现PcAMY1基因在广藿香的嫩茎、成熟茎、老茎、嫩叶、成熟叶、老叶中均有表达说明该基因表达存在普遍性，而叶的3个时期中成熟叶表达最高，成熟叶大，颜色绿，α-淀粉在光合作用中起着非常大的作用；茎的3个时期中老茎表达最高，3种不同时期的茎，嫩茎、成熟茎、老茎相比，老茎的纤维含量最高，成熟茎次之，嫩茎含纤维最少，这说明α-淀粉酶在纤维的形成中可能起着一定的作用。目前在其它物种中尚未有AMY基因的表达研究。
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参考文献
[1] 廖 芳. 野桑蚕淀粉酶基因的分段克隆， 序列分析及其分子系统学研究[D]. 北碚： 西南农业大学， 2003.
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[17] Kiyohara H， Ichino C， Kawamura Y， et al. Patchouli alcohol： in vitro direct anti-influenza virus sesquiterpene in Pogostemon cablin Benth[J]. J Natl Med， 2012， 66： 55-61.
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