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摘要采用L16（45）正交试验设计，对褐飞虱SRAPPCR反应体系中的Mg2 、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物浓度和DNA模板浓度5个因素进行优化，确立了褐飞虱SRAPPCR最佳的反应体系。结果表明：褐飞虱SRAPPCR最佳反应体系为：总体积10 μL，Mg2 浓度3 mmol/L、dNTPs为150 μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、正反向引物各0.3 μmol/L、DNA用量25 ng以及1×PCR Buffer。使用生物型1雌虫与生物型2雄虫单对杂交F2群体对优化后的褐飞虱SRAPPCR反应体系进行验证，获得了条带清晰、多态性丰富的图谱，并发现共显性条带，表明确定的反应体系稳定可靠。
关键词褐飞虱；SRAPPCR；正交试验；反应体系优化
中图分类号:S 435.112.3文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2014.02.020Optimization and establishment of SRAPPCR reaction system
for the brown planthopperZhang Lei1，Jing Shengli2，He Guangcun2，Jiang Lei1，Li Gang1，
Liu Hong1，Qin Rui1（1. Engineering Research Center for Protection and Utilization of Biological Resources in Minority
Regions, SouthCentral University for Nationalities, Wuhan430074, China； 2. State Key
Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan430072, China）AbstractBy the orthogonal experimental design L16 (45), five factors, including Mg2 , dNTPs, Taq DNA polymerase, primer concentration and DNA template concentrations in Nilaparvata lugens SRAPPCR reaction system, were optimized, and the optimal reaction system of the brown planthopper SRAPPCR was established. The results showed that a suitable SRAPPCR reaction system was constructed with 10 μL volume containing 25 ng of template DNA, 0.3 μmol/L of each of the two primers, 150 μmol/L deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), 3 mmol/L MgCl2, 1 × PCR buffer, and 2 unit of Taq DNA polymerase. We used the females of biotypes 1 and the males of biotype 2 monomer hybridization population for the optimal reaction system. The results showed that the bands were clear, with rich polymorphism and codominant bands. It showed that the reaction system is stable and reliable.
Key wordsbrown planthopper；SRAPPCR；orthogonal experiment；optimization of reaction system 褐飞虱(Nilaparvata lugens Stl)是一种重要的水稻害虫,具有极强的变异性和适应性。目前，褐飞虱的防治主要是通过种植含有抗性基因的水稻品种而减轻其危害。然而，褐飞虱与寄主相互作用以及协同进化，分化出了适应不同抗性水稻的生物型，最终导致其危害越来越严重［12］。在分子生物学研究方面，当前的研究主要集中在同工酶标记［3］和微卫星（SSR）标记以及随机扩增多态性(RAPD) 标记对不同群体进行遗传多样性研究以及遗传连锁图谱的构建［49］。
SRAP（sequencerelated amplified polymorphism）是 Li等［10］在芸薹作物建立并开发的一种新型分子标记技术。该技术是利用正反引物检测基因组开放阅读框（ORFs）区域，与RAPD、AFLP、SSR等常规标记相比，SRAP标记克服了AFLP标记的成本高、技术繁杂等问题，同时也克服了RAPD标记的重复性不足、SSR标记引物设计需要预先知道序列信息的缺点，有着操作简便、中等产率、易于测序、在基因组中分布均匀等特点。现在广泛地运用于植物分子生物学研究中，如遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位等［11］。但是，SRAP标记运用于昆虫学的研究很少，目前只有对异色瓢虫的研究报道［12］。本研究中，采用正交试验设计，对影响褐飞虱SRAPPCR 反应体系的Mg2 浓度、dNTPs 浓度、TaqDNA 聚合酶用量、引物浓度和模板DNA 用量5个因素进行优化试验，并且对所优化的体系进行验证，建立适用于褐飞虱的SRAPPCR反应体系，为进一步利用SRAP 标记技术开展褐飞虱遗传多样性研究和遗传连锁图谱构建及致害基因定位等研究工作提供一定的技术支持。
40卷第2期张磊等：褐飞虱SRAPPCR体系的优化与确立20141材料和方法
1.1材料
供试褐飞虱材料来自于武汉大学生命科学院杂交水稻国家重点实验室。SRAPPCR体系优化所使用生物型2褐飞虱，体系确定采用生物型1雌虫与生物型2雄虫单对杂交F2群体。
试验中使用的Taq DNA聚合酶和Mg2 购自Fermentas公司，dNTPs来自北京奥博克达科技有限公司，SRAP引物由华大基因合成。序列如表1。
表1用于褐飛虱基因组DNA的SRAPPCR反应序列
Table 1The primer sequences used for SRAPPCR of
genomic DNA form Nilaparvata lugens 正向引物
Forward primer5′→3′序列
5′→3′Sequence反向引物
Reverse primer5′→3′序列
5′→3′SequenceMe4TGAGTCCAAA
CCGGAAGEm1GACTGCGTA
CGAATTAATMe10TGAGTCCAAA
CCGGAGAEm3GACTGCGTA
CGAATTATGMe14TGAGTCCAAA
CCGGTTGEm6GACTGCGTA
CGAATTTAG
1.2方法
1.2.1基因组DNA的提取与检测
参照Tang等［13］的方法，采用CTAB法提取单头褐飞虱基因组DNA。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样本提取的效果，使用Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪检测DNA浓度和纯度。用ddH2O统一稀释至50 ng/μL，-20 ℃保存。
1.2.2SRAPPCR反应体系的正交试验设计
以生物型2褐飞虱基因组DNA为材料，采用L16（45）正交表对Mg2 、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物浓度和DNA模板浓度5个因素4水平进行正交试验设计。其中各因素的4个水平为Mg2 2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L、dNTPs 100.0、150.0、200.0、250.0 μmol/L、TaqDNA 聚合酶 0.5、1.0、1.5、2.0 U、引物 0.2、0.25、0.3、0.35 μmol/L 以及模板DNA浓度 25.0、50.0、75.0、100.0 ng，16个反应体系组合如表2所示，重复3次。PCR扩增反应引物选用Me10Em1引物组合，反应总体积为10 μL，含有1×PCR Buffer，总体积不足用ddH2O补足。
表2正交试验设计表
Table 2Orthogonal design for SRAPPCR编号
No.因素和水平 Factor and levelMg2
/mmol·L-1dNTPs
/μmol·L-1Taq/UPrimer
/μmol·L-1DNA/ng12.01000.50.202522.01501.00.255032.02001.50.307542.02502.00.3510052.51001.00.3010062.51500.50.357572.52002.00.205082.52501.50.252593.01001.50.3550103.01502.00.3025113.02000.50.25100123.02501.00.2075133.51002.00.2575143.51501.50.20100153.52001.00.3525163.52500.50.3050
1.2.3SRAPPCR扩增及检测
扩增程序参照Li等的反应程序，使用PTC100 thermal cycler (MJ Research)。采用6%变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，60 W恒功率电泳1～1.5 h，采用银染法显色，拍照。
1.2.4褐飞虱最佳SRAPPCR反应体系的验证
以生物型1雌虫与生物型2雄虫单对杂交F2群体中48个体的基因组DNA为模板，随机选取Me4Em6和Me14Em3引物组合，按优化的体系进行扩增，对其稳定性及可靠性进行检测。
1.3数据统计分析
采用 Excel 2007 软件对正交试验结果进行统计分析。
2结果与分析
2.1正交试验结果的分析
如图1所示，在16个组合中，由于Mg2 、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物浓度和DNA模板浓度5个因素组合不同，扩增结果存在明显差异。其中，1、6、12、14组扩增效果不理想；第7、10、16组扩增效果较好，由于第7组条带重复性较差，第16组条带不清晰，综合以上因素初步确定第10组（Mg2 浓度3 mmol/L、dNTPs为150 μmol/L、Taq DNA聚合酶2U、正反向primer各03 μmol/L、DNA用量25 ng）为最适反应体系。
图1正交试验电泳分析结果
Fig.1Electrophoresis of orthogonal design
对16个组合进行评价，按照重复性、条带清晰度和丰富度3个标准进行打分，满分16分，最低0分。16个组合的分数依次是6、9、8、9、7、5、14、9、9、16、7、6、7、6、7、11。根据分数求得每个因素水平下的平均值K以及同一因素不同水平间的平均值极差R。结果(表3)表明，對褐飞虱基因组DNA的SRAPPCR反应体系影响最大的是TaqDNA聚合酶和模板浓度，影响最小的是Mg2 和dNTPs浓度。根据正交试验的结果，理论上最适体系为Mg2 浓度3 mmol/L、dNTPs为150（200） μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、正反向Primer各0.3 μmol/L、DNA用量50 ng。
2.2褐飞虱SRAPPCR反应体系的确定
根据图1的直观分析结果和表3的统计分析结果进行综合分析，两者的主要差异在于DNA的用量。当DNA用量为25 ng和50 ng时，Ki的差别很小，根据直观图对比7组和10组时，两者的差异很小，考虑到试验成本问题将DNA用量确定为25 ng。
综上所述，最终确定褐飞虱SRAPPCR最佳反应体系为：总体积10 μL，Mg2 浓度3 mmol/L、dNTPs为150 μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、正反向引物各0.3 μmol/L、DNA用量25 ng以及1×PCR Buffer。
表3正交试验统计学分析1)
Table 3Statistical analysis of orthogonal design编号
No.因素和水平Factor and levelMg2
/mmol·L-1dNTPs
/μmol·L-1Taq/UPrimer
/μmol·L-1DNA/ngK 18.007.257.258.09.50K28.609.007.258.010.75K39.509.008.0010.56.50K47.758.7511.507.57.25R1.751.754.253.04.25
1) K:各因素水平下的平均值; R:各因素的极差。
K: The average value of each factor level;R: The range of each factor.
2.3褐飞虱最佳SRAP反应体系的验证
应用上述得出的最适反应体系，选择引物组合Me4Em6和Me14Em3对生物型1雌虫与生物型2雄虫单对杂交F2群体进行验证。结果如图2和图3所示，图2中，Me4Em6引物组合扩增出16条条带，其中多态性条带16条，多态性比率为100%。并在箭头所示处扩增出共显性条带。图3中，Me14Em3引物组合扩增出14条条带，其中多态性条带12条，多态性比率为85.71%，并发现2个共显性条带，如图中箭头所示，扩增清晰，重复性好，证明此体系为褐飞虱SRAPPCR最佳体系。
图2Me4Em6体系确定电泳分析结果
Fig.2Me4Em6 system for determining the results of electrophoresis
图3Me14Em3体系确定电泳分析结果
Fig.3Me14Em3 system for determining the results of electrophoresis3讨论
SRAPPCR技术主要运用于植物领域，很少涉及动物领域。在昆虫中，该技术的应用仅见于异色瓢虫，在褐飞虱研究中尚未见报道，本研究将丰富SRAPPCR技术在昆虫学中的应用。笔者对F2群体进行体系验证发现，随机选取的Me4Em6和Me14Em3引物组合多态性比率分别高达100%和85.71%，完全可以区分种群内各个个体，表明该技术对研究褐飞虱种群遗传结构同样适用，是一种高效鉴定褐飞虱的技术。同时也发现，SRAP技术也具有较好的共显性，如Me4Em6与Me14Em3引物组合中可分别观察到1条和2条共显性条带，而且条带清晰，可以用于遗传连锁图谱的构建以及基因定位。
此前的SRAPPCR体系优化研究发现，反应体系因材料而异，如药用菊花［14］和荷花［15］的SRAPPCR反应体系相似，但是与辣椒［16］的反应体系差别较大。本研究中得出的结果与异色瓢虫基因组SRAPPCR反应体系优化的结果除了Mg2 用量差别较大外，其余影响因素的变化趋势相同，统计分析后发现，各影响因素由强到弱依次是TaqDNA聚合酶、DNA模板用量、引物用量、Mg2 以及dNTPs。但是在一些植物学的研究中，如在石蒜［17］的SRAPPCR反应体系中Mg2 浓度对扩增的影响最为显著。而在菊花［14］的研究中发现dNTPs浓度对体系的影响最大。在菊花和百里香属［18］的研究中发现DNA模板的用量对扩增效果有重要影响。但是在柿属［19］以及百里香属植物的研究中发现TaqDNA聚合酶用量对体系影响甚微。说明不同的物种间SRAPPCR反应体系虽然相似，但会因物种基因组结构的不同导致引物差异，从而造成反应体系彼此之间的差异，因此，SRAPPCR技术应用的关键就是首先必须针对不同的材料建立成熟的反应体系并进行优化。
此前，许多研究者也运用不同分子生物学技术对不同褐飞虱群体进行过研究，如Shufran和Whalon［20］ 用RAPD分子标记技术研究了生物型1、生物型2和生物型3三种褐飞虱种群，结果表明，不同生物型的个体之间RAPD带型存在差异，但是聚类分析却不能区分生物型类型；Jing等［21］利用ESTSSR对4种生物型褐飞虱种群进行研究，该方法可以对各生物型种群以及种群内个体进行区分，而且重复性好，该技术主要针对非编码区序列的分析。而SRAP技术主要用于基因组开放阅读框（ORFs）区域的扩增，是从编码片段的多态性来研究生物个体间基因组结构的差异，从而分析生物种群的结构。在植物学领域，SRAP技术被广泛地应用于遗传连锁的构建以及基因定位，并显示了巨大的潜力［2225］。譬如，Sun等［26］绘制了一个包含13 551个SRAP标记的甘蓝型油菜的遗传连锁图谱，但在研究中共使用了1 637对SRAP引物组合，表明一对SRAP引物包含多个共显性位点。SRAP技术的优点在于不需要详细了解基因组序列而设计引物，如果能根据褐飞虱基因组的特点，开发出适合褐飞虱的SRAP标记，这将对褐飞虱的资源鉴定、遗传连锁图谱的构建以及致害基因定位提供更快捷的技术支持。
参考文献
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個大豆疫霉菌游动孢子和0.06个卵孢子，对染病组织的检测也表现出了较高的灵敏度，这都为本研究葡萄霜霉病菌PCR检测法的建立提供了借鉴。
本研究通过对已测序和已报道的葡萄霜霉病菌的cox2基因序列进行同源性比对分析，设计合成了一对用于P.viticola检测的引物FPv/RPv。利用该引物对包括P.viticola在内的30种常见植物病原真菌（包括15种Plasmopara属真菌、8种葡萄常见致病菌）的基因组DNA进行了PCR扩增，验证引物FPv/RPv的特异性，结果表明：该引物特异性强，仅P.viticola基因组DNA作为模板的PCR扩增产物呈现一条600 bp左右的特异性条带，其他参照菌株及阴性对照均无任何条带；灵敏度验证结果表明，该检测法可以检测出3.3 pg/μL 水平的P.viticola基因组DNA；应用该方法对来自全国不同葡萄产区不同品种的78份葡萄霜霉病菌进行了检测，结果表明，该检测法适用范围广，且检测准确率达100%。
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关键词褐飞虱；SRAPPCR；正交试验；反应体系优化
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Key wordsbrown planthopper；SRAPPCR；orthogonal experiment；optimization of reaction system 褐飞虱(Nilaparvata lugens Stl)是一种重要的水稻害虫,具有极强的变异性和适应性。目前，褐飞虱的防治主要是通过种植含有抗性基因的水稻品种而减轻其危害。然而，褐飞虱与寄主相互作用以及协同进化，分化出了适应不同抗性水稻的生物型，最终导致其危害越来越严重［12］。在分子生物学研究方面，当前的研究主要集中在同工酶标记［3］和微卫星（SSR）标记以及随机扩增多态性(RAPD) 标记对不同群体进行遗传多样性研究以及遗传连锁图谱的构建［49］。
SRAP（sequencerelated amplified polymorphism）是 Li等［10］在芸薹作物建立并开发的一种新型分子标记技术。该技术是利用正反引物检测基因组开放阅读框（ORFs）区域，与RAPD、AFLP、SSR等常规标记相比，SRAP标记克服了AFLP标记的成本高、技术繁杂等问题，同时也克服了RAPD标记的重复性不足、SSR标记引物设计需要预先知道序列信息的缺点，有着操作简便、中等产率、易于测序、在基因组中分布均匀等特点。现在广泛地运用于植物分子生物学研究中，如遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位等［11］。但是，SRAP标记运用于昆虫学的研究很少，目前只有对异色瓢虫的研究报道［12］。本研究中，采用正交试验设计，对影响褐飞虱SRAPPCR 反应体系的Mg2 浓度、dNTPs 浓度、TaqDNA 聚合酶用量、引物浓度和模板DNA 用量5个因素进行优化试验，并且对所优化的体系进行验证，建立适用于褐飞虱的SRAPPCR反应体系，为进一步利用SRAP 标记技术开展褐飞虱遗传多样性研究和遗传连锁图谱构建及致害基因定位等研究工作提供一定的技术支持。
40卷第2期张磊等：褐飞虱SRAPPCR体系的优化与确立20141材料和方法
1.1材料
供试褐飞虱材料来自于武汉大学生命科学院杂交水稻国家重点实验室。SRAPPCR体系优化所使用生物型2褐飞虱，体系确定采用生物型1雌虫与生物型2雄虫单对杂交F2群体。
试验中使用的Taq DNA聚合酶和Mg2 购自Fermentas公司，dNTPs来自北京奥博克达科技有限公司，SRAP引物由华大基因合成。序列如表1。
表1用于褐飛虱基因组DNA的SRAPPCR反应序列
Table 1The primer sequences used for SRAPPCR of
genomic DNA form Nilaparvata lugens 正向引物
Forward primer5′→3′序列
5′→3′Sequence反向引物
Reverse primer5′→3′序列
5′→3′SequenceMe4TGAGTCCAAA
CCGGAAGEm1GACTGCGTA
CGAATTAATMe10TGAGTCCAAA
CCGGAGAEm3GACTGCGTA
CGAATTATGMe14TGAGTCCAAA
CCGGTTGEm6GACTGCGTA
CGAATTTAG
1.2方法
1.2.1基因组DNA的提取与检测
参照Tang等［13］的方法，采用CTAB法提取单头褐飞虱基因组DNA。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样本提取的效果，使用Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪检测DNA浓度和纯度。用ddH2O统一稀释至50 ng/μL，-20 ℃保存。
1.2.2SRAPPCR反应体系的正交试验设计
以生物型2褐飞虱基因组DNA为材料，采用L16（45）正交表对Mg2 、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物浓度和DNA模板浓度5个因素4水平进行正交试验设计。其中各因素的4个水平为Mg2 2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L、dNTPs 100.0、150.0、200.0、250.0 μmol/L、TaqDNA 聚合酶 0.5、1.0、1.5、2.0 U、引物 0.2、0.25、0.3、0.35 μmol/L 以及模板DNA浓度 25.0、50.0、75.0、100.0 ng，16个反应体系组合如表2所示，重复3次。PCR扩增反应引物选用Me10Em1引物组合，反应总体积为10 μL，含有1×PCR Buffer，总体积不足用ddH2O补足。
表2正交试验设计表
Table 2Orthogonal design for SRAPPCR编号
No.因素和水平 Factor and levelMg2
/mmol·L-1dNTPs
/μmol·L-1Taq/UPrimer
/μmol·L-1DNA/ng12.01000.50.202522.01501.00.255032.02001.50.307542.02502.00.3510052.51001.00.3010062.51500.50.357572.52002.00.205082.52501.50.252593.01001.50.3550103.01502.00.3025113.02000.50.25100123.02501.00.2075133.51002.00.2575143.51501.50.20100153.52001.00.3525163.52500.50.3050
1.2.3SRAPPCR扩增及检测
扩增程序参照Li等的反应程序，使用PTC100 thermal cycler (MJ Research)。采用6%变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，60 W恒功率电泳1～1.5 h，采用银染法显色，拍照。
1.2.4褐飞虱最佳SRAPPCR反应体系的验证
以生物型1雌虫与生物型2雄虫单对杂交F2群体中48个体的基因组DNA为模板，随机选取Me4Em6和Me14Em3引物组合，按优化的体系进行扩增，对其稳定性及可靠性进行检测。
1.3数据统计分析
采用 Excel 2007 软件对正交试验结果进行统计分析。
2结果与分析
2.1正交试验结果的分析
如图1所示，在16个组合中，由于Mg2 、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物浓度和DNA模板浓度5个因素组合不同，扩增结果存在明显差异。其中，1、6、12、14组扩增效果不理想；第7、10、16组扩增效果较好，由于第7组条带重复性较差，第16组条带不清晰，综合以上因素初步确定第10组（Mg2 浓度3 mmol/L、dNTPs为150 μmol/L、Taq DNA聚合酶2U、正反向primer各03 μmol/L、DNA用量25 ng）为最适反应体系。
图1正交试验电泳分析结果
Fig.1Electrophoresis of orthogonal design
对16个组合进行评价，按照重复性、条带清晰度和丰富度3个标准进行打分，满分16分，最低0分。16个组合的分数依次是6、9、8、9、7、5、14、9、9、16、7、6、7、6、7、11。根据分数求得每个因素水平下的平均值K以及同一因素不同水平间的平均值极差R。结果(表3)表明，對褐飞虱基因组DNA的SRAPPCR反应体系影响最大的是TaqDNA聚合酶和模板浓度，影响最小的是Mg2 和dNTPs浓度。根据正交试验的结果，理论上最适体系为Mg2 浓度3 mmol/L、dNTPs为150（200） μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、正反向Primer各0.3 μmol/L、DNA用量50 ng。
2.2褐飞虱SRAPPCR反应体系的确定
根据图1的直观分析结果和表3的统计分析结果进行综合分析，两者的主要差异在于DNA的用量。当DNA用量为25 ng和50 ng时，Ki的差别很小，根据直观图对比7组和10组时，两者的差异很小，考虑到试验成本问题将DNA用量确定为25 ng。
综上所述，最终确定褐飞虱SRAPPCR最佳反应体系为：总体积10 μL，Mg2 浓度3 mmol/L、dNTPs为150 μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、正反向引物各0.3 μmol/L、DNA用量25 ng以及1×PCR Buffer。
表3正交试验统计学分析1)
Table 3Statistical analysis of orthogonal design编号
No.因素和水平Factor and levelMg2
/mmol·L-1dNTPs
/μmol·L-1Taq/UPrimer
/μmol·L-1DNA/ngK 18.007.257.258.09.50K28.609.007.258.010.75K39.509.008.0010.56.50K47.758.7511.507.57.25R1.751.754.253.04.25
1) K:各因素水平下的平均值; R:各因素的极差。
K: The average value of each factor level;R: The range of each factor.
2.3褐飞虱最佳SRAP反应体系的验证
应用上述得出的最适反应体系，选择引物组合Me4Em6和Me14Em3对生物型1雌虫与生物型2雄虫单对杂交F2群体进行验证。结果如图2和图3所示，图2中，Me4Em6引物组合扩增出16条条带，其中多态性条带16条，多态性比率为100%。并在箭头所示处扩增出共显性条带。图3中，Me14Em3引物组合扩增出14条条带，其中多态性条带12条，多态性比率为85.71%，并发现2个共显性条带，如图中箭头所示，扩增清晰，重复性好，证明此体系为褐飞虱SRAPPCR最佳体系。
图2Me4Em6体系确定电泳分析结果
Fig.2Me4Em6 system for determining the results of electrophoresis
图3Me14Em3体系确定电泳分析结果
Fig.3Me14Em3 system for determining the results of electrophoresis3讨论
SRAPPCR技术主要运用于植物领域，很少涉及动物领域。在昆虫中，该技术的应用仅见于异色瓢虫，在褐飞虱研究中尚未见报道，本研究将丰富SRAPPCR技术在昆虫学中的应用。笔者对F2群体进行体系验证发现，随机选取的Me4Em6和Me14Em3引物组合多态性比率分别高达100%和85.71%，完全可以区分种群内各个个体，表明该技术对研究褐飞虱种群遗传结构同样适用，是一种高效鉴定褐飞虱的技术。同时也发现，SRAP技术也具有较好的共显性，如Me4Em6与Me14Em3引物组合中可分别观察到1条和2条共显性条带，而且条带清晰，可以用于遗传连锁图谱的构建以及基因定位。
此前的SRAPPCR体系优化研究发现，反应体系因材料而异，如药用菊花［14］和荷花［15］的SRAPPCR反应体系相似，但是与辣椒［16］的反应体系差别较大。本研究中得出的结果与异色瓢虫基因组SRAPPCR反应体系优化的结果除了Mg2 用量差别较大外，其余影响因素的变化趋势相同，统计分析后发现，各影响因素由强到弱依次是TaqDNA聚合酶、DNA模板用量、引物用量、Mg2 以及dNTPs。但是在一些植物学的研究中，如在石蒜［17］的SRAPPCR反应体系中Mg2 浓度对扩增的影响最为显著。而在菊花［14］的研究中发现dNTPs浓度对体系的影响最大。在菊花和百里香属［18］的研究中发现DNA模板的用量对扩增效果有重要影响。但是在柿属［19］以及百里香属植物的研究中发现TaqDNA聚合酶用量对体系影响甚微。说明不同的物种间SRAPPCR反应体系虽然相似，但会因物种基因组结构的不同导致引物差异，从而造成反应体系彼此之间的差异，因此，SRAPPCR技术应用的关键就是首先必须针对不同的材料建立成熟的反应体系并进行优化。
此前，许多研究者也运用不同分子生物学技术对不同褐飞虱群体进行过研究，如Shufran和Whalon［20］ 用RAPD分子标记技术研究了生物型1、生物型2和生物型3三种褐飞虱种群，结果表明，不同生物型的个体之间RAPD带型存在差异，但是聚类分析却不能区分生物型类型；Jing等［21］利用ESTSSR对4种生物型褐飞虱种群进行研究，该方法可以对各生物型种群以及种群内个体进行区分，而且重复性好，该技术主要针对非编码区序列的分析。而SRAP技术主要用于基因组开放阅读框（ORFs）区域的扩增，是从编码片段的多态性来研究生物个体间基因组结构的差异，从而分析生物种群的结构。在植物学领域，SRAP技术被广泛地应用于遗传连锁的构建以及基因定位，并显示了巨大的潜力［2225］。譬如，Sun等［26］绘制了一个包含13 551个SRAP标记的甘蓝型油菜的遗传连锁图谱，但在研究中共使用了1 637对SRAP引物组合，表明一对SRAP引物包含多个共显性位点。SRAP技术的优点在于不需要详细了解基因组序列而设计引物，如果能根据褐飞虱基因组的特点，开发出适合褐飞虱的SRAP标记，这将对褐飞虱的资源鉴定、遗传连锁图谱的构建以及致害基因定位提供更快捷的技术支持。
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個大豆疫霉菌游动孢子和0.06个卵孢子，对染病组织的检测也表现出了较高的灵敏度，这都为本研究葡萄霜霉病菌PCR检测法的建立提供了借鉴。
本研究通过对已测序和已报道的葡萄霜霉病菌的cox2基因序列进行同源性比对分析，设计合成了一对用于P.viticola检测的引物FPv/RPv。利用该引物对包括P.viticola在内的30种常见植物病原真菌（包括15种Plasmopara属真菌、8种葡萄常见致病菌）的基因组DNA进行了PCR扩增，验证引物FPv/RPv的特异性，结果表明：该引物特异性强，仅P.viticola基因组DNA作为模板的PCR扩增产物呈现一条600 bp左右的特异性条带，其他参照菌株及阴性对照均无任何条带；灵敏度验证结果表明，该检测法可以检测出3.3 pg/μL 水平的P.viticola基因组DNA；应用该方法对来自全国不同葡萄产区不同品种的78份葡萄霜霉病菌进行了检测，结果表明，该检测法适用范围广，且检测准确率达100%。
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