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【摘 要】目的：探讨羊水产前诊断在地中海贫血（以下简称“地贫”）胎儿中的应用，通过羊水产前诊断，检出中、重型地贫儿，知情选择终止妊娠，降低出生缺陷。方法：采用GaP-PCR方法诊断中国人常见的东南亚型（--SEA）基因缺失、-α3.7基因缺失和 -α4.2基因缺失；采用反向斑點杂交法（PCR-RDB）检测常见的αT珠蛋白基因αCS、αQS 和αWS 3种点突变及17种β-地贫基因突变类型，对100例孕妇羊水进行产前地贫基因检测。结果：检测出正常胎儿 23例占 23%，异常胎儿77例占77%。其中，α-地贫胎儿 42 例占42%，β-地贫19 例占19%，α复合β-地贫16 例占 16%。结论：在孕中期对高危人群行羊水产前诊断可以有效地阻止中、重型地贫患儿的出生，从而降低出生缺陷。
【关键词】地中海贫血；产前诊断；羊水；出生缺陷
【中图分类号】R714 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）01-0245-02
地中海贫血（简称地贫）是一类由于α或β珠蛋白基因发生缺失或点突变，使其编码的人α或β珠蛋白链缺如或不足，导致严重的溶血性贫血[1]。全世界至少有3.45亿人携带地中海贫血的致病基因，我国长江以南各省区为高发区。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，主要分为α-地贫和β-地贫两种类型。α、β-地贫根据临床症状的严重程度不同，又可以分为静止型地贫、轻型地贫、中间型及重型地贫。静止型和轻型地贫无需特殊治疗，中、重型地贫除了输血外，国内外尚无有效的治疗方法，重点在于预防[2]。为探讨我市预防中、重症地贫的有效手段及其效果，现对来我院优生遗传门诊就诊的100例确诊为同型地贫基因携带夫妇的胎儿进行产前地贫基因诊断，将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料选取2016年1月～2017年12月在本院优生遗传门诊就诊的 100 对同型地贫基因携带者，通过优生遗传咨询，并知情选择进行羊膜腔穿刺术产前基因诊断夫妇，其中，同为α-地贫基因携带者 48 对，同为β地贫基因携带者19 对，同型地贫且一方为α复合β地贫携带者 33 对，孕妇年龄在19～42岁，孕周18～24周，受检夫妇均来自河池市户籍，术前签署知情同意书。
1.2 检测方法
1.2.1 标本采集孕妇排空膀胱，取仰卧位，常规严格无菌消毒，产前诊断医生在B 超引导下，用羊膜腔穿刺针穿刺进入羊膜腔，抽前2ml 羊水弃去，以防母体细胞污染，再抽取羊水20ml，分别置2根10ml无菌离心管中，每管10ml，交实验室人员，标本用于DNA 的初次提取及细胞培养后的二次平行实验。
1.2.2 基因检测
（1）α珠蛋白基因检测采用Gap-PCR方法诊断中国人常见的东南亚型（--SEA）基因缺失、-α3.7 基因缺失和 -α4.2基因缺失；采用反向斑点杂交法（PCR-RDB）检测常见的αT珠蛋白基因αCS、αQS和αWS 3种点突变型地贫基因，基因诊断试剂盒购自深圳益生堂生物企业有限公司，检测方法按试剂盒操作说明书进行。
（2）β珠蛋白基因检测采用PCR结合反向斑点杂交法（PCR-RDB），检测中国人常见的β-地贫17种基因突变类型，基因诊断试剂盒购自深圳益生堂生物企业有限公司，检测方法按试剂盒操作说明书进行。
1.3 遗传咨询 地贫基因诊断结果以书面报告形式送交到孕妇手中，随后由遗传医生对其进行遗传咨询并给予相应的医学建议，胎儿诊断为重型或中间型α或β-地中海贫血，告知胎儿预后，提出知情选择的医学指导意见。另外，根据产前诊断管理方案，羊水地贫基因检测报告由2名专业技术人员签发，审核人必须具备副高以上专业技术职称；检测结果的原始数据和标本必须保存至少3年，DNA标本须保存于-70℃[3]。
1.4 随访 100 例孕妇均在产前诊断后6个月由专人电话随访，了解中重型地贫胎儿结局、非中重型地贫胎儿出生后表型和发育情况。中重型地贫胎儿引产者，取胎儿脐血行地贫基因检测，其余继续妊娠分娩者，出生后2个月抽取外周血行地贫基因检测，以验证产前诊断结果的准确性。
2 结果
100例羊水标本中，检测出正常胎儿23例占 23%，异常胎儿77例占77%。其中，α-地贫胎儿42 例占42%，β-地贫19例19%，α复合β地贫 16 例占 16%。
2.1 夫妇为同型α地贫的产前诊断结果，见表1。
夫妇为同型α-地贫携带者共 48对，产前诊断检出正常胎儿 15例（31.25%），异常胎儿33例（68.75%），其中，静止型α-地贫6 例（12.50%），轻型α-地贫14例（29.17%），中间型α-地贫8例（16.67%），Bart’s 水肿胎 5例（10.42%）。
2.2 夫妇为同型β-地贫的产前诊断结果，见表2
夫妇为同型β-地贫携带者共19对，产前诊断检出正常胎儿7 例（36.84%），异常胎儿12例（63.16%），其中，轻型β-地贫7例（36.84%），重型β地贫5例（26.32%）。
2.3 夫妇一方为α复合β-地贫的同型地贫产前基因诊断结果，见表3。
夫妇同型地贫且一方为α复合β-地贫共33例，检出正常胎儿1例，异常胎儿32例，其中，静止型α-地贫3例，轻型α-地贫1例，中间型α-地贫4例，Bart’s 水肿胎1例。轻型β-地贫3例，重型β-地贫4例，α复合β-地贫16例（静止型α-地贫或轻型α-地贫复合轻型β-地贫9例，中间型α-地贫复合轻型β-地贫4例，重型α-地贫复合轻型β-地贫1例，静止型α-地贫或轻型α-地贫复合重型β-地贫2例 ）。
2.4 随访 100 例行产前诊断的孕妇随访未发生术后并发症， 20例胎儿引产（包括7例Bart’s水肿胎，2例中间型α-地贫， 1例中间型α-地贫复合轻型β-地贫，8例重型β-地贫，2例重型β-地贫复合轻型α-地贫），引产胎儿取脐血行地贫基因诊断，其余继续妊娠胎儿，则出生后2个月抽取外周血行地贫基因检测，均与产前诊断结果一致。10例HbH病及1例重型β地贫胎儿母亲知情选择继续妊娠，这例重型β地贫胎儿孕妇在妊娠期间，当地卫计委及医务人员多次上门动员其终止妊娠，均不同意，只能尊重其意愿。所有胎儿出生后半年电话随访，除1例重型β地贫患儿需输血外，其他无重度贫血表型。 3 讨论
地贫是一组严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病，是人类最常见的单基因遗传病之一。重型α-地贫胎儿多在妊娠末期胎死腹中或分娩后死亡；重型β-地贫患兒一般在出生后3～6个月出现症状，需输血维持生命，不接受治疗的患儿常常因发育迟缓而呈典型的“地贫面容”，常在5岁以前因严重贫血或继发感染在儿童期死亡[4]。根据广西2010年的地贫流调显示，广西地贫发病率最高，人群携带率为24.51%，α-地贫携带率为17.55%，β地贫携带率为6.43%，高于广东地区[5]。由于同型地贫携带者生育重型地贫患儿的风险为25%，高携带率导致孕育高风险胎儿增加，而且在临床上尚无有效的根治手段，因此，对夫妇双方为同型地贫基因携带者的孕妇，进行产前诊断，避免重症地贫儿出生，是最积极有效的预防措施。目前临床上常用的产前诊断方法有早孕期绒毛穿刺、妊中期羊膜腔穿刺和脐带血穿刺，其中羊膜腔穿刺安全性高，具有操作简便、并发症少和流产率低的优点 [6] ，是目前用于产前诊断的主要方法。
本资料显示在我院行羊水产前诊断的100 例孕妇，检测出正常胎儿 23例，异常胎儿77例，异常胎儿检出率为77%。其中，α-地贫42例占42.0%，β-地贫19例占 19.0%，α复合β-地贫16例占16%，结果显示α-地贫发生率最高，由此可见地贫在广西的高发性和严重性；在检出的异常胎儿中，中、重型地贫胎儿28 例，占比为28%；其中，20例孕妇咨询后知情选择终止妊娠，包括7例Bart’s 水肿胎，2例中间型α-地贫（-- SEA /αCSα；αCSα/αCSα）， 1例中间型α-地贫复合轻型β地（-- SEA /αCSα复合β41-42），8 例重型β-地贫，2例重型β-地贫复合轻型α-地贫；另外1例重型β-地贫及7例中间型α-地贫继续妊娠。从研究结果看出，基本上重型地贫胎儿经咨询医生后均选择终止妊娠，这样在一定程度上减轻了给社会及家庭带来的沉重精神负担和经济负担。而HbH病的胎儿则由孕妇及配偶决定胎儿的去留，但仍有极个别妊娠重型地贫胎儿孕妇，因为文化程度低，对地贫的知晓率差，依从性低，会选择继续妊娠，因为患儿出生后巨大的医药费，往往因疾返贫，后悔莫及。因此，在人群中大力宣传地贫的防控知识，开展产前诊断是非常有必要的。
本研究显示100对同型地贫基因携带夫妇中，有33对夫妇其中一方为α复合β-地贫携带者，所占比例为33%。王光丽等[7]报道，广西桂林地区175对同型地贫基因携带夫妇中，仅有 20 对其中一方为α复合β-地贫携带者，所占比例为11.42%，明显低于本研究。上述结果提示本地区地贫基因的复杂性，必将增加地贫防治工作的难度，这需要我们临床医生在工作中不断积累经验，当夫妇一方是复合型地贫时，另一方不论筛查结果是阳性或阴性，均应行α-地贫基因检测，因为，静止型α-地贫筛查低，容易导致漏诊。
从本研究显示及随访结果看，20例胎儿引产后取脐血行地贫基因诊断，80例继续妊娠胎儿，则在出生后2个月抽取婴儿外周血行地贫基因检测，均与产前诊断结果一致。所有胎儿出生后半年电话随访，除1例重型β地贫患儿需输血外，其他无重度贫血表型。100 例行产前诊断的孕妇随访未发生术后并发症，无死胎、流产及宫内感染等等并发症；本研究中的 100 例地贫羊水产前诊断，成功率高，并发症少，方法可靠，值得大力推广。
预防出生缺陷有三道防线：一级预防：婚检、孕前优生优育检查及孕期保健等；二级预防：产前筛查与产前诊断；三级预防：针对已出生的缺陷儿进行有针对性的矫治。河池市于2013年开始陆续在全市范围内开展了地中海贫血防控项目，以及应用监测信息管理系统对纳入管理的目标人群实行免费地贫基因检测。通过对婚检、孕检地贫筛查、地贫基因检测、地贫高风险的孕妇进行羊膜腔穿刺产前诊断，是减少出生缺陷、提高出生人口高素质的必要手段。
参考文献
[1]Higgs DR，Engel JD，Stamatoyannopoulos G.Thalassaemia [J] Lancet，2012，379（9813）：373-383.
[2]付春云，陈少科，张强等.珠蛋白生成障碍性贫血的预防策略及问题[J].检验医学与临床，2014（19）：2756-2757.
[3]徐湘民.地中海贫血预防控制操作指南[M].北京：人民军医出版社，2011.6.
[4]苏金玉，翟惠敏.β-地中海贫血输血治疗的研究进展[J].广东医学，2011，32（15）：2063-2065.
[5]广西地中海贫血防治计划培训教材陈荔丽等P1.
[6]Najmabadi H，Ghamari A，Sahebjam F，et al. Fourteen-Year experience of prenatal diagnosis of thalassemia in Iran [J].Community Genet，2006，9（2）：93-97.
[7]王光丽，郑海清，曾 丹，等.桂林地区产前地中海贫血基因诊断175例分析[J].中国优生与遗传杂志2018，26（6）：30.
作者简介：
杨艳，女，1965年生，广西河池市妇幼保健院产科副主任医师，1988年毕业于广西河池地区卫生学校妇幼医士专业，分配到广西河池市妇幼保健院妇产科，2000年毕业于广西医学院临床医学专业，长期从事妇产科临床及优生遗传咨询工作。
【关键词】地中海贫血；产前诊断；羊水；出生缺陷
【中图分类号】R714 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）01-0245-02
地中海贫血（简称地贫）是一类由于α或β珠蛋白基因发生缺失或点突变，使其编码的人α或β珠蛋白链缺如或不足，导致严重的溶血性贫血[1]。全世界至少有3.45亿人携带地中海贫血的致病基因，我国长江以南各省区为高发区。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，主要分为α-地贫和β-地贫两种类型。α、β-地贫根据临床症状的严重程度不同，又可以分为静止型地贫、轻型地贫、中间型及重型地贫。静止型和轻型地贫无需特殊治疗，中、重型地贫除了输血外，国内外尚无有效的治疗方法，重点在于预防[2]。为探讨我市预防中、重症地贫的有效手段及其效果，现对来我院优生遗传门诊就诊的100例确诊为同型地贫基因携带夫妇的胎儿进行产前地贫基因诊断，将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料选取2016年1月～2017年12月在本院优生遗传门诊就诊的 100 对同型地贫基因携带者，通过优生遗传咨询，并知情选择进行羊膜腔穿刺术产前基因诊断夫妇，其中，同为α-地贫基因携带者 48 对，同为β地贫基因携带者19 对，同型地贫且一方为α复合β地贫携带者 33 对，孕妇年龄在19～42岁，孕周18～24周，受检夫妇均来自河池市户籍，术前签署知情同意书。
1.2 检测方法
1.2.1 标本采集孕妇排空膀胱，取仰卧位，常规严格无菌消毒，产前诊断医生在B 超引导下，用羊膜腔穿刺针穿刺进入羊膜腔，抽前2ml 羊水弃去，以防母体细胞污染，再抽取羊水20ml，分别置2根10ml无菌离心管中，每管10ml，交实验室人员，标本用于DNA 的初次提取及细胞培养后的二次平行实验。
1.2.2 基因检测
（1）α珠蛋白基因检测采用Gap-PCR方法诊断中国人常见的东南亚型（--SEA）基因缺失、-α3.7 基因缺失和 -α4.2基因缺失；采用反向斑点杂交法（PCR-RDB）检测常见的αT珠蛋白基因αCS、αQS和αWS 3种点突变型地贫基因，基因诊断试剂盒购自深圳益生堂生物企业有限公司，检测方法按试剂盒操作说明书进行。
（2）β珠蛋白基因检测采用PCR结合反向斑点杂交法（PCR-RDB），检测中国人常见的β-地贫17种基因突变类型，基因诊断试剂盒购自深圳益生堂生物企业有限公司，检测方法按试剂盒操作说明书进行。
1.3 遗传咨询 地贫基因诊断结果以书面报告形式送交到孕妇手中，随后由遗传医生对其进行遗传咨询并给予相应的医学建议，胎儿诊断为重型或中间型α或β-地中海贫血，告知胎儿预后，提出知情选择的医学指导意见。另外，根据产前诊断管理方案，羊水地贫基因检测报告由2名专业技术人员签发，审核人必须具备副高以上专业技术职称；检测结果的原始数据和标本必须保存至少3年，DNA标本须保存于-70℃[3]。
1.4 随访 100 例孕妇均在产前诊断后6个月由专人电话随访，了解中重型地贫胎儿结局、非中重型地贫胎儿出生后表型和发育情况。中重型地贫胎儿引产者，取胎儿脐血行地贫基因检测，其余继续妊娠分娩者，出生后2个月抽取外周血行地贫基因检测，以验证产前诊断结果的准确性。
2 结果
100例羊水标本中，检测出正常胎儿23例占 23%，异常胎儿77例占77%。其中，α-地贫胎儿42 例占42%，β-地贫19例19%，α复合β地贫 16 例占 16%。
2.1 夫妇为同型α地贫的产前诊断结果，见表1。
夫妇为同型α-地贫携带者共 48对，产前诊断检出正常胎儿 15例（31.25%），异常胎儿33例（68.75%），其中，静止型α-地贫6 例（12.50%），轻型α-地贫14例（29.17%），中间型α-地贫8例（16.67%），Bart’s 水肿胎 5例（10.42%）。
2.2 夫妇为同型β-地贫的产前诊断结果，见表2
夫妇为同型β-地贫携带者共19对，产前诊断检出正常胎儿7 例（36.84%），异常胎儿12例（63.16%），其中，轻型β-地贫7例（36.84%），重型β地贫5例（26.32%）。
2.3 夫妇一方为α复合β-地贫的同型地贫产前基因诊断结果，见表3。
夫妇同型地贫且一方为α复合β-地贫共33例，检出正常胎儿1例，异常胎儿32例，其中，静止型α-地贫3例，轻型α-地贫1例，中间型α-地贫4例，Bart’s 水肿胎1例。轻型β-地贫3例，重型β-地贫4例，α复合β-地贫16例（静止型α-地贫或轻型α-地贫复合轻型β-地贫9例，中间型α-地贫复合轻型β-地贫4例，重型α-地贫复合轻型β-地贫1例，静止型α-地贫或轻型α-地贫复合重型β-地贫2例 ）。
2.4 随访 100 例行产前诊断的孕妇随访未发生术后并发症， 20例胎儿引产（包括7例Bart’s水肿胎，2例中间型α-地贫， 1例中间型α-地贫复合轻型β-地贫，8例重型β-地贫，2例重型β-地贫复合轻型α-地贫），引产胎儿取脐血行地贫基因诊断，其余继续妊娠胎儿，则出生后2个月抽取外周血行地贫基因检测，均与产前诊断结果一致。10例HbH病及1例重型β地贫胎儿母亲知情选择继续妊娠，这例重型β地贫胎儿孕妇在妊娠期间，当地卫计委及医务人员多次上门动员其终止妊娠，均不同意，只能尊重其意愿。所有胎儿出生后半年电话随访，除1例重型β地贫患儿需输血外，其他无重度贫血表型。 3 讨论
地贫是一组严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病，是人类最常见的单基因遗传病之一。重型α-地贫胎儿多在妊娠末期胎死腹中或分娩后死亡；重型β-地贫患兒一般在出生后3～6个月出现症状，需输血维持生命，不接受治疗的患儿常常因发育迟缓而呈典型的“地贫面容”，常在5岁以前因严重贫血或继发感染在儿童期死亡[4]。根据广西2010年的地贫流调显示，广西地贫发病率最高，人群携带率为24.51%，α-地贫携带率为17.55%，β地贫携带率为6.43%，高于广东地区[5]。由于同型地贫携带者生育重型地贫患儿的风险为25%，高携带率导致孕育高风险胎儿增加，而且在临床上尚无有效的根治手段，因此，对夫妇双方为同型地贫基因携带者的孕妇，进行产前诊断，避免重症地贫儿出生，是最积极有效的预防措施。目前临床上常用的产前诊断方法有早孕期绒毛穿刺、妊中期羊膜腔穿刺和脐带血穿刺，其中羊膜腔穿刺安全性高，具有操作简便、并发症少和流产率低的优点 [6] ，是目前用于产前诊断的主要方法。
本资料显示在我院行羊水产前诊断的100 例孕妇，检测出正常胎儿 23例，异常胎儿77例，异常胎儿检出率为77%。其中，α-地贫42例占42.0%，β-地贫19例占 19.0%，α复合β-地贫16例占16%，结果显示α-地贫发生率最高，由此可见地贫在广西的高发性和严重性；在检出的异常胎儿中，中、重型地贫胎儿28 例，占比为28%；其中，20例孕妇咨询后知情选择终止妊娠，包括7例Bart’s 水肿胎，2例中间型α-地贫（-- SEA /αCSα；αCSα/αCSα）， 1例中间型α-地贫复合轻型β地（-- SEA /αCSα复合β41-42），8 例重型β-地贫，2例重型β-地贫复合轻型α-地贫；另外1例重型β-地贫及7例中间型α-地贫继续妊娠。从研究结果看出，基本上重型地贫胎儿经咨询医生后均选择终止妊娠，这样在一定程度上减轻了给社会及家庭带来的沉重精神负担和经济负担。而HbH病的胎儿则由孕妇及配偶决定胎儿的去留，但仍有极个别妊娠重型地贫胎儿孕妇，因为文化程度低，对地贫的知晓率差，依从性低，会选择继续妊娠，因为患儿出生后巨大的医药费，往往因疾返贫，后悔莫及。因此，在人群中大力宣传地贫的防控知识，开展产前诊断是非常有必要的。
本研究显示100对同型地贫基因携带夫妇中，有33对夫妇其中一方为α复合β-地贫携带者，所占比例为33%。王光丽等[7]报道，广西桂林地区175对同型地贫基因携带夫妇中，仅有 20 对其中一方为α复合β-地贫携带者，所占比例为11.42%，明显低于本研究。上述结果提示本地区地贫基因的复杂性，必将增加地贫防治工作的难度，这需要我们临床医生在工作中不断积累经验，当夫妇一方是复合型地贫时，另一方不论筛查结果是阳性或阴性，均应行α-地贫基因检测，因为，静止型α-地贫筛查低，容易导致漏诊。
从本研究显示及随访结果看，20例胎儿引产后取脐血行地贫基因诊断，80例继续妊娠胎儿，则在出生后2个月抽取婴儿外周血行地贫基因检测，均与产前诊断结果一致。所有胎儿出生后半年电话随访，除1例重型β地贫患儿需输血外，其他无重度贫血表型。100 例行产前诊断的孕妇随访未发生术后并发症，无死胎、流产及宫内感染等等并发症；本研究中的 100 例地贫羊水产前诊断，成功率高，并发症少，方法可靠，值得大力推广。
预防出生缺陷有三道防线：一级预防：婚检、孕前优生优育检查及孕期保健等；二级预防：产前筛查与产前诊断；三级预防：针对已出生的缺陷儿进行有针对性的矫治。河池市于2013年开始陆续在全市范围内开展了地中海贫血防控项目，以及应用监测信息管理系统对纳入管理的目标人群实行免费地贫基因检测。通过对婚检、孕检地贫筛查、地贫基因检测、地贫高风险的孕妇进行羊膜腔穿刺产前诊断，是减少出生缺陷、提高出生人口高素质的必要手段。
参考文献
[1]Higgs DR，Engel JD，Stamatoyannopoulos G.Thalassaemia [J] Lancet，2012，379（9813）：373-383.
[2]付春云，陈少科，张强等.珠蛋白生成障碍性贫血的预防策略及问题[J].检验医学与临床，2014（19）：2756-2757.
[3]徐湘民.地中海贫血预防控制操作指南[M].北京：人民军医出版社，2011.6.
[4]苏金玉，翟惠敏.β-地中海贫血输血治疗的研究进展[J].广东医学，2011，32（15）：2063-2065.
[5]广西地中海贫血防治计划培训教材陈荔丽等P1.
[6]Najmabadi H，Ghamari A，Sahebjam F，et al. Fourteen-Year experience of prenatal diagnosis of thalassemia in Iran [J].Community Genet，2006，9（2）：93-97.
[7]王光丽，郑海清，曾 丹，等.桂林地区产前地中海贫血基因诊断175例分析[J].中国优生与遗传杂志2018，26（6）：30.
作者简介：
杨艳，女，1965年生，广西河池市妇幼保健院产科副主任医师，1988年毕业于广西河池地区卫生学校妇幼医士专业，分配到广西河池市妇幼保健院妇产科，2000年毕业于广西医学院临床医学专业，长期从事妇产科临床及优生遗传咨询工作。