论文部分内容阅读
摘 要 以储良龙眼为试材，通过分析低温诱导、氧化胁迫、自然低温+药剂处理龙眼成化过程中氧化损伤各指标变化，研究龙眼成花和氧化胁迫之间的相关性。结果表明，氧化胁迫有利于龙眼成花。对顶芽和叶片活性氧、抗坏血酸和丙二醛（MDA）含量的检测结果也表明，氧化胁迫诱导龙眼成花的同时，也导致了龙眼树各组织活性氧的累积，且抗坏血酸抑制龙眼成花，MDA促进龙眼成花。因此认为活性氧与龙眼成花呈正相关。
关键词 龙眼；成花；氧化损伤；活性氧；丙二醛；抗坏血酸
中图分类号 S667.2 文献标识码 A
Relationship Between Longan Flower and Oxidative Damage
YANG Ziqin1， CHEN Xingxing2， ZHANG Lei1， HONG Jiwang1， CHEN Yeyuan1 *， LI Songgang1 *
1 Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Tropical Crops Genetic
Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， National Cultivar Improvement Center of
Tropical Fruit Tree， Danzhou，Hainan 571737， China
2 Henan Vocational College of Agriculture， Zhengzhou， Henan 451450， China
Abstract Low temperature induced， oxidative stress， natural low temperature combined with medicament spraying were used to study the correlation between longan-flowering and oxidative stress. Results indicated that oxidative stress induced longan flower， and led to the accumulation of reactive oxygen in parts of longan tree organizations， while ascorbic acid inhibited longan flower， MDA promoted longan flower. It confirmed there was a positive correlation between longan flower and active oxygen.
Key words Longan； Flower； Oxidative damage； Reactive oxygen species； MDA； Ascorbic acid
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.020
花芽分化标志着植物从营养生长向生殖生长的转化。经验发现，在植物与环境的互作中适当的胁迫往往促进开花，如适当的断根和干旱胁迫有利于柑桔成花[1]；低温、氧化胁迫、甚至嫁接不亲和都能诱导龙眼果树的成花[2-4]；干旱胁迫诱导枇杷[5]的成花；高温胁迫可诱导水仙花FT-like NFT1基因高量表达[6]；干旱胁迫造成了拟南芥中包括FLOWER LOCUS T（FT）基因在内的4 153个成花相关基因差异表达[7]。胁迫条件的发生同时伴随着活性氧的累积，低温可使荔枝花芽的H2O2含量升高，相对电导率增大，对冷敏性强的荔枝会造成氧化胁迫与活性氧产生/清除的平衡失调[8]，植物的防御系统在低温逆境条件下会被破坏，导致活性氧大量积累，进而造成生物膜的严重损害[9]。外施H2O2和NO促进剂可以诱导蝴蝶兰花器官中游离氧离子的浓度增加，进而增加氧化损伤和脂质过氧化及SOD、APX和非特异性过氧化物酶（POD）的活性，同时造成过氧化氢酶（CAT）和GR的活性降低[10]。
Lokhande[11]等发现H2O2是诱导拟南芥开花的一个因子。低温胁迫可诱导荔枝混合花芽中H2O2和NO含量上升；H2O2和NO发生剂硝普钠和百草枯处理同样增加荔枝混合花芽中NO和H2O2含量，促进抽生纯花芽。NO合酶抑制剂L-NNA和H2O2清除剂DMTU抑制荔枝成花，这间接证明H2O2和NO对荔枝成花有调控作用[12]。而有相反的报道认为，NO供体硝普钠的应用导致拟南芥开花延迟，通过遗传筛选发现拟南芥突变体具有高或低的内源性NO水平，从而延迟或提早开花；高浓度的NO抑制花分生组织中LFY基因的表达和CO基因对成花的促进作用；此外，增加了成花限制基因FLC的表达[13]。但是，这些胁迫信号分子与成花之间的作用机理目前尚不明确。对于龙眼而言，低温及氧化胁迫究竟引发了怎样的生理变化，这些信号物质是如何参与龙眼成花的诱导，从而开启开花程序并关闭营养生长的程序还尚不清楚。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为8年生的石硖龙眼（Dimocarpus longan Loureiro），试材均常规管理。
1.2 方法
试验材料包含3种处理方式龙眼果树。人工低温诱导采用8～10 ℃（12 h）/18～22 ℃（12 h），光照模拟自然光，在末次冬梢成熟后进行人工低温诱导，胁迫后42 d侧花原基形成。低温诱导试验系统以单株为实验单元，设5次重复。每隔7 d采集样品1次，采集的样品包含叶片与顶芽。 氧化胁迫采用的龙眼树在正造季节摘除花序，在新梢抽生3次后进行催花，催花药剂为：土施氯酸钾+氯化钾诱导成花（W氯酸钾 ∶ W氯化钾=6 ∶ 4，
0.5 kg/m树冠直径），催花后28 d侧花原基形成。氧化胁迫试验以单株为试验单元，设5次重复。每隔7 d采集样品1次，采集的样品包含叶片与顶芽。
药剂处理：对冬季自然低温龙眼树末次冬梢成熟后20 d的梢芽喷施药剂，以单株为试验单元，设5次重复。每个药剂处理每株树喷施15个枝梢，每天采集样品1次，直至侧花原基形成，采集的样品为顶芽。药剂处理包含：脱落酸（ABA）100 mg/L；ABA阻断剂，钨酸钠（Sodium tungstate dihydrate， STD）5 mmol/L；H2O2清除剂，二甲基硫脲（DMTU）1 g/L；H2O2发生剂，百草枯（MV）20 mg/L；NO发生剂，硝普钠（SNP）0.1 mmol/L；NO合酶抑制剂，（L-NNA） 0.1 mmol/L；以喷施水为对照。喷施方式为枝梢喷施，喷施至滴水。
活性氧检测采用DAB染色法：将需要检测的组织浸泡于DAB染液中（1 mg/mL，pH5.8）28 ℃避光保存8 h；倒弃染液，80%乙醇沸浴2 min，重复2次；用无水乙醇沸浴至颜色不变；倒弃液体，再浸泡于无水乙醇中于4 ℃保持4 h后观测并拍照，活性氧含量越高则颜色越深。
抗坏血酸含量采用高俊凤的方法[14]测定。
MDA含量采用硫代巴比妥酸法[15]测定。
抗坏血酸、MDA含量均以样品鲜重（FW）为基数。
1.3 数据统计与分析
采用SPSS16.0软件处理试验数据和方差分析。
2 结果与分析
2.1 氧化胁迫对成花过程中龙眼各部分活性氧分布的影响
DAB染色结果（图1）显示：氧化胁迫导致龙眼树体各组织出现不同程度的活性氧累积；随着龙眼成花进程的推进，活性氧累积也在加重。尤以顶芽、老茎髓部及韧皮部积累活性氧最多，嫩茎积累活性氧次之。氧化胁迫对叶片活性氧累积影响不大。
2.2 龙眼成花与抗坏血酸含量的关系
抗坏血酸在植物体遭遇逆境时具有重要的抗氧化作用，而逆境中抗坏血酸含量越高，植物体逆境伤害就会越轻。在整个花芽形成过程中，龙眼叶片的抗坏血酸含量（W抗坏血酸）远低于顶芽（图2）。在枝梢成熟后0 d，叶片抗坏血酸含量为2.83 mg/g，直至侧花原基形成之前都在此水平上下波动；至侧花原基形成时才上升至4.71 mg/g，并在随后的1周内迅速下降。而顶芽中的抗坏血酸含量在枝梢刚成熟时虽仅有4.92 mg/g，但随后7 d内上升至8.42 mg/g，并在枝梢成熟14 d时上升至最高峰（8.93 mg/g）；在枝梢成熟后28 d顶芽抗坏血酸含量降到低谷（5.20 mg/g），在侧花原基形成时顶芽中抗坏血酸含量再次上升至峰值（8.38 mg/g）。
氧化胁迫龙眼顶芽的抗坏血酸含量也远高于叶片（图3）。催花对叶片中抗坏血酸含量影响不大，催花之初为2.24 mg/g，随后仅有小幅上升，并在小范围内波动（2.48～3.16 mg/g）；顶芽中抗坏血酸含量在催花之初较高，达到9.91 mg/g，而在催花后下降，并在7 d中跌至低谷（6.07 mg/g），随后又缓慢上升，侧花原基形成时达到7.02 mg/g。
2.3 龙眼成花与MDA含量的关系
MDA是细胞膜脂过氧化作用的产物之一；MDA产生数量的多少，代表细胞膜脂过氧化的程度，可间接反映植物组织受伤的程度。除了个别时段（枝梢成熟后14 d）以外，低温诱导龙眼枝梢成熟后的叶片MDA含量CMDA均高于顶芽（图4）。在枝梢成熟后0 d，叶片中MDA含量为16.83 nmol/g，顶芽中MDA含量为14.45 nmol/g；枝梢成熟后7 d，叶片中MDA含量出现小幅下降（12.67 nmol/g），并维持该水平直至枝梢成熟后42 d（此时为侧花原基形成时），MDA含量上升至36.73 nmol/g，随后下降到枝梢成熟时水平；顶芽中MDA含量变化除枝梢成熟后14 d时出现1个高峰（26.80 nmol/g）外，在整个花芽形成阶段均徘徊在10.44～16.10 nmol/g。
在催花之后，龙眼叶片和顶芽的MDA含量均出现了2次高峰（图5）。其中，叶片的高峰分别出现在催花后0 d（21.35 nmol/g）和21 d（18.98 nmol/g），其他阶段均在14.22～17.12 nmol/g内波动；顶芽的高峰分别出现在催花后14 d（25.06 nmol/g）和28 d（21.98 nmol/g），其他阶段均在14.02～16.53 nmol/g范围内。在整个氧化胁迫成花过程中，除了顶芽出现2次高峰的时间外，其余时间均以叶片的MDA含量最高。
为了弄清楚活性氧及其上下游产物对龙眼成花的作用，本研究采用了信号清除剂及阻断剂处理，以期探明活性氧损伤在龙眼成花中的确切作用。这些信号类药剂对顶芽MDA含量的影响差别很大（图6）：在喷药1 d后，DMTU和SNP处理的MDA含量上升最多，分别达到62.88和32.74 nmol/g，其它各处理略高于对照水平（14.97 nmol/g）；喷药3 d后，又回复到处理之前的水平；喷药5 d后，仍然以SNP处理的MDA含量最高，达到34.54 nmol/g，DMTU、MV、L-NNA的MDA含量也略高于对照水平，而STD和ABA处理却导致了顶芽MDA含量低于对照水平；喷药7 d后，除了STD和ABA处理外其它各处理均达到了前所未有的MDA含量水平，STD和ABA处理分别为16.23和18.03 nmol/g，SNP、DMTU、MV和L-NNA的MDA含量依次为47.04、70.58、40.93、46.62 nmol/g。 3 讨论与结论
3.1 活性氧与龙眼成花的关系
活性氧信号在调节植物发育和应对胁迫反应方面具有重要作用，但关于活性氧如何调节花芽分化的报道很少。作为比较稳定的一种活性氧信号分子，H2O2可调节基因的表达，进而调控许多生理过程，包括产生系统抗性、诱导气孔关闭、诱发过敏性反应等[16]。Lokhande等[11]发现，拟南芥开花前的抗坏血酸过氧化物酶活性越高则开花越迟，氧化胁迫越强开花早，即抗坏血酸含量越低，开花越早，抗坏血酸与开花呈负相关，这与本试验结论相同。对于低温胁迫诱导龙眼成花，叶片中抗坏血酸在侧花原基形成时含量上升的原因可能是叶片在此阶段已不需要过多的活性氧来促进花芽形成，而过多的活性氧在侧花原基形成之后阻碍了花序的抽生。顶芽是龙眼花芽分化的发生部位，在遭遇冷胁迫之后，应激性的抗坏血酸含量上升是缓冲顶芽对氧化损伤的反应。而后顶芽启动花芽分化则需要活性氧的累积，抗坏血酸出现下降，并在侧花原基形成之后继续起到抑制顶芽氧化伤害的作用。氧化胁迫较低温胁迫所产生的氧化损伤更为直接，作用部位直接在顶芽组织上，对叶片的影响不大，这与活性氧在龙眼各组织中的分布互相印证。顶芽中抗坏血酸含量的下降预示着氧化胁迫所产生的活性氧将更多的累积于顶芽而无抑制因素的参与。这使得氧化胁迫诱导成花周期较低温诱导更短。这与低温诱导龙眼在末次冬梢成熟后42 d形成侧花原基，而氧化胁迫龙眼在催花之后28 d形成侧花原基互为佐证。
3.2 MDA、抗坏血酸与龙眼成花的关系
MDA与抗坏血酸所表示的氧化损伤意义恰恰相反，如叶片抗坏血酸含量低于顶芽，叶片MDA含量高于顶芽。低温胁迫初期顶芽MDA曾一度高于叶片，可能是启动侧花原基的标志，而后期叶片MDA在侧花原基形成前后的爆发可能是因为顶芽活性氧的下降，使得叶片活性氧向顶芽极性运输所致。NO是动物细胞重要的第二信使，但更多的试验表明，它同时也是植物细胞中一种重要的信号分子，在超氧阴离子的配合下信号分子NO可以转变成具有毒性的亚硝酸根阴离子[17-19]，NO作为信号分子与活性氧协同作用启动植物的应逆反应[20]。Zafra等[21]发现油橄榄成花过程有赖于H2O2和NO的参与。本试验中NO促进剂喷施导致龙眼顶芽MDA含量升高，对龙眼顶芽的损伤较大，但却促进了龙眼早花的出现，这与Zafra的结论相同。
综上所述，氧化损伤与龙眼成花呈正相关，抗坏血酸抑制龙眼成花，而MDA促进龙眼成花。
参考文献
[1] 刘春荣. 温州蜜柑断根和留叶对成花的效应[J]. 福建果树， 1991， 2（1）： 6.
[2] 黄旭明， 陆洁梅， 王惠聪. 氯酸盐在龙眼生产上的应用和研究现状[J]. 中国南方果树， 2004， 31（1）： 62-64.
[3] 张海岚， 吴定尧， 林晓东. 氧化剂催花可使龙眼周年开花着果[J]. 中国南方果树， 2002， 31（1）： 26-27.
[4] Yamada M， Takeno K. Stress and salicylic acid induce the expression of PnFT2 in the regulation of the stress-induced flowering of Pharbitis nil[J]. Journal of Plant Physiology， 2014， 171（3-4）： 205-212.
[5] 陈贵虎， 张云鹏， 蒋建国， 等. 枇杷幼旺树促花技术研究[J]. 西南园艺， 2004， 32（3）： 40-42.
[6] Li X F， Jia L Y， Xu J， et al. FT-like NFT1 gene may play a role in flower transition induced by heat accumulation in Narcissus tazetta var. chinensis[J]. Plant & Cell Physiology， 2013， 54（2）： 270-281.
[7] Su Z， Ma X， Guo H， et al. Flower development under drought stress： morphological and transcriptomic analyses reveal acute responses and long-term acclimation in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2013， 25（10）： 3 785-3 807.
[8] 鲁 勇， 吴楚彬， 陈厚彬， 等. 不同发育时期的荔枝花芽冷敏感性比较[J]. 果树学报， 2013， 30（1）： 115-120.
[9] Li C Y， Weiss D， Goldschmidt E E. Girdling affects carbohydrate-related gene expression in leaves， bark and roots of alternate-bearing citrus trees[J]. Annals of Botany， 2003， 92（1）： 137-143.
[10] Tewari R K， Kumar P， Kim S， et al. Nitric oxide retards xanthine oxidase-mediated superoxide anion generation in Phalaenopsis flower： an implication of NO in the senescence and oxidative stress regulation[J]. Plant Cell Reports， 2009， 28（2）： 267-279. [11] Lokhande S D， Ogawa K， Tanaka A， et al. Effect of temperature on ascorbate peroxidase activity and flowering of Arabidopsis thaliana ecotypes under different light conditions[J]. Journal of Plant Physiology， 2003， 160（1）： 57-64.
[12] Zhou B， Li N， Zhang Z， et al. Hydrogen peroxide and nitric oxide promote reproductive growth in Litchi chinensis[J]. Biologia Plantarum， 56（2）： 321-329.
[13] He Y， Tang R H， Hao Y， et al. Nitric oxide represses the Arabidopsis floral transition[J]. Science， 2004， 305： 1 968-1 971.
[14] 高俊凤. 植物生理学实验技术[M]. 北京： 世界图书出版公司， 2000： 162-163.
[15] 郝建军， 康宗利， 于 洋. 植物生理学实验技术[M]. 北京： 化学工业出版社， 2006： 159-160.
[16] Vanderauwera S， Zimmermann P， Rombauts S， et al. Genome-wide analysis of hydrogen peroxide-regulated gene expression in Arabidopsis reveals a high light-induced transcriptional cluster involved in anthocyanin biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2005， 139（2）： 806-821.
[17] Beligni M V， Lamattina L. Nitric oxide： a non-traditional regulator of plant growth[J]. Trends in Plant Science， 2001， 6（11）： 508-509.
[18] Zhang L， Si J， Zeng F， et al. Molecular cloning and characterization of a ferritin gene upregulated by cold stress in Chorispora bungeana[J]. Biological Trace Element Research， 2009， 128（3）： 269-283.
[19] 吴丽元， 党西强， 何小解，等. 儿茶素清除超氧阴离子对Ang II诱导的内皮祖细胞NO与eNOS表达及凋亡影响[J]. 中国当代儿科杂志， 2009， 11（6）： 476-480.
[20] Del Rio D， Serafini M， Pellegrini N. Selected methodologies to assess oxidative/antioxidant status in vivo： a critical review[J]. Nutrition， Metabolism， and Cardiovascular Diseases， 2002， 12（6）： 343-351.
[21] Zafra A， Rodríguez-García M I， Alché J D. Cellular localization of ROS and NO in olive reproductive tissues during flower development[J]. BMC Plant Biology， 2010， 10： 36.
关键词 龙眼；成花；氧化损伤；活性氧；丙二醛；抗坏血酸
中图分类号 S667.2 文献标识码 A
Relationship Between Longan Flower and Oxidative Damage
YANG Ziqin1， CHEN Xingxing2， ZHANG Lei1， HONG Jiwang1， CHEN Yeyuan1 *， LI Songgang1 *
1 Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Tropical Crops Genetic
Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， National Cultivar Improvement Center of
Tropical Fruit Tree， Danzhou，Hainan 571737， China
2 Henan Vocational College of Agriculture， Zhengzhou， Henan 451450， China
Abstract Low temperature induced， oxidative stress， natural low temperature combined with medicament spraying were used to study the correlation between longan-flowering and oxidative stress. Results indicated that oxidative stress induced longan flower， and led to the accumulation of reactive oxygen in parts of longan tree organizations， while ascorbic acid inhibited longan flower， MDA promoted longan flower. It confirmed there was a positive correlation between longan flower and active oxygen.
Key words Longan； Flower； Oxidative damage； Reactive oxygen species； MDA； Ascorbic acid
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.020
花芽分化标志着植物从营养生长向生殖生长的转化。经验发现，在植物与环境的互作中适当的胁迫往往促进开花，如适当的断根和干旱胁迫有利于柑桔成花[1]；低温、氧化胁迫、甚至嫁接不亲和都能诱导龙眼果树的成花[2-4]；干旱胁迫诱导枇杷[5]的成花；高温胁迫可诱导水仙花FT-like NFT1基因高量表达[6]；干旱胁迫造成了拟南芥中包括FLOWER LOCUS T（FT）基因在内的4 153个成花相关基因差异表达[7]。胁迫条件的发生同时伴随着活性氧的累积，低温可使荔枝花芽的H2O2含量升高，相对电导率增大，对冷敏性强的荔枝会造成氧化胁迫与活性氧产生/清除的平衡失调[8]，植物的防御系统在低温逆境条件下会被破坏，导致活性氧大量积累，进而造成生物膜的严重损害[9]。外施H2O2和NO促进剂可以诱导蝴蝶兰花器官中游离氧离子的浓度增加，进而增加氧化损伤和脂质过氧化及SOD、APX和非特异性过氧化物酶（POD）的活性，同时造成过氧化氢酶（CAT）和GR的活性降低[10]。
Lokhande[11]等发现H2O2是诱导拟南芥开花的一个因子。低温胁迫可诱导荔枝混合花芽中H2O2和NO含量上升；H2O2和NO发生剂硝普钠和百草枯处理同样增加荔枝混合花芽中NO和H2O2含量，促进抽生纯花芽。NO合酶抑制剂L-NNA和H2O2清除剂DMTU抑制荔枝成花，这间接证明H2O2和NO对荔枝成花有调控作用[12]。而有相反的报道认为，NO供体硝普钠的应用导致拟南芥开花延迟，通过遗传筛选发现拟南芥突变体具有高或低的内源性NO水平，从而延迟或提早开花；高浓度的NO抑制花分生组织中LFY基因的表达和CO基因对成花的促进作用；此外，增加了成花限制基因FLC的表达[13]。但是，这些胁迫信号分子与成花之间的作用机理目前尚不明确。对于龙眼而言，低温及氧化胁迫究竟引发了怎样的生理变化，这些信号物质是如何参与龙眼成花的诱导，从而开启开花程序并关闭营养生长的程序还尚不清楚。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为8年生的石硖龙眼（Dimocarpus longan Loureiro），试材均常规管理。
1.2 方法
试验材料包含3种处理方式龙眼果树。人工低温诱导采用8～10 ℃（12 h）/18～22 ℃（12 h），光照模拟自然光，在末次冬梢成熟后进行人工低温诱导，胁迫后42 d侧花原基形成。低温诱导试验系统以单株为实验单元，设5次重复。每隔7 d采集样品1次，采集的样品包含叶片与顶芽。 氧化胁迫采用的龙眼树在正造季节摘除花序，在新梢抽生3次后进行催花，催花药剂为：土施氯酸钾+氯化钾诱导成花（W氯酸钾 ∶ W氯化钾=6 ∶ 4，
0.5 kg/m树冠直径），催花后28 d侧花原基形成。氧化胁迫试验以单株为试验单元，设5次重复。每隔7 d采集样品1次，采集的样品包含叶片与顶芽。
药剂处理：对冬季自然低温龙眼树末次冬梢成熟后20 d的梢芽喷施药剂，以单株为试验单元，设5次重复。每个药剂处理每株树喷施15个枝梢，每天采集样品1次，直至侧花原基形成，采集的样品为顶芽。药剂处理包含：脱落酸（ABA）100 mg/L；ABA阻断剂，钨酸钠（Sodium tungstate dihydrate， STD）5 mmol/L；H2O2清除剂，二甲基硫脲（DMTU）1 g/L；H2O2发生剂，百草枯（MV）20 mg/L；NO发生剂，硝普钠（SNP）0.1 mmol/L；NO合酶抑制剂，（L-NNA） 0.1 mmol/L；以喷施水为对照。喷施方式为枝梢喷施，喷施至滴水。
活性氧检测采用DAB染色法：将需要检测的组织浸泡于DAB染液中（1 mg/mL，pH5.8）28 ℃避光保存8 h；倒弃染液，80%乙醇沸浴2 min，重复2次；用无水乙醇沸浴至颜色不变；倒弃液体，再浸泡于无水乙醇中于4 ℃保持4 h后观测并拍照，活性氧含量越高则颜色越深。
抗坏血酸含量采用高俊凤的方法[14]测定。
MDA含量采用硫代巴比妥酸法[15]测定。
抗坏血酸、MDA含量均以样品鲜重（FW）为基数。
1.3 数据统计与分析
采用SPSS16.0软件处理试验数据和方差分析。
2 结果与分析
2.1 氧化胁迫对成花过程中龙眼各部分活性氧分布的影响
DAB染色结果（图1）显示：氧化胁迫导致龙眼树体各组织出现不同程度的活性氧累积；随着龙眼成花进程的推进，活性氧累积也在加重。尤以顶芽、老茎髓部及韧皮部积累活性氧最多，嫩茎积累活性氧次之。氧化胁迫对叶片活性氧累积影响不大。
2.2 龙眼成花与抗坏血酸含量的关系
抗坏血酸在植物体遭遇逆境时具有重要的抗氧化作用，而逆境中抗坏血酸含量越高，植物体逆境伤害就会越轻。在整个花芽形成过程中，龙眼叶片的抗坏血酸含量（W抗坏血酸）远低于顶芽（图2）。在枝梢成熟后0 d，叶片抗坏血酸含量为2.83 mg/g，直至侧花原基形成之前都在此水平上下波动；至侧花原基形成时才上升至4.71 mg/g，并在随后的1周内迅速下降。而顶芽中的抗坏血酸含量在枝梢刚成熟时虽仅有4.92 mg/g，但随后7 d内上升至8.42 mg/g，并在枝梢成熟14 d时上升至最高峰（8.93 mg/g）；在枝梢成熟后28 d顶芽抗坏血酸含量降到低谷（5.20 mg/g），在侧花原基形成时顶芽中抗坏血酸含量再次上升至峰值（8.38 mg/g）。
氧化胁迫龙眼顶芽的抗坏血酸含量也远高于叶片（图3）。催花对叶片中抗坏血酸含量影响不大，催花之初为2.24 mg/g，随后仅有小幅上升，并在小范围内波动（2.48～3.16 mg/g）；顶芽中抗坏血酸含量在催花之初较高，达到9.91 mg/g，而在催花后下降，并在7 d中跌至低谷（6.07 mg/g），随后又缓慢上升，侧花原基形成时达到7.02 mg/g。
2.3 龙眼成花与MDA含量的关系
MDA是细胞膜脂过氧化作用的产物之一；MDA产生数量的多少，代表细胞膜脂过氧化的程度，可间接反映植物组织受伤的程度。除了个别时段（枝梢成熟后14 d）以外，低温诱导龙眼枝梢成熟后的叶片MDA含量CMDA均高于顶芽（图4）。在枝梢成熟后0 d，叶片中MDA含量为16.83 nmol/g，顶芽中MDA含量为14.45 nmol/g；枝梢成熟后7 d，叶片中MDA含量出现小幅下降（12.67 nmol/g），并维持该水平直至枝梢成熟后42 d（此时为侧花原基形成时），MDA含量上升至36.73 nmol/g，随后下降到枝梢成熟时水平；顶芽中MDA含量变化除枝梢成熟后14 d时出现1个高峰（26.80 nmol/g）外，在整个花芽形成阶段均徘徊在10.44～16.10 nmol/g。
在催花之后，龙眼叶片和顶芽的MDA含量均出现了2次高峰（图5）。其中，叶片的高峰分别出现在催花后0 d（21.35 nmol/g）和21 d（18.98 nmol/g），其他阶段均在14.22～17.12 nmol/g内波动；顶芽的高峰分别出现在催花后14 d（25.06 nmol/g）和28 d（21.98 nmol/g），其他阶段均在14.02～16.53 nmol/g范围内。在整个氧化胁迫成花过程中，除了顶芽出现2次高峰的时间外，其余时间均以叶片的MDA含量最高。
为了弄清楚活性氧及其上下游产物对龙眼成花的作用，本研究采用了信号清除剂及阻断剂处理，以期探明活性氧损伤在龙眼成花中的确切作用。这些信号类药剂对顶芽MDA含量的影响差别很大（图6）：在喷药1 d后，DMTU和SNP处理的MDA含量上升最多，分别达到62.88和32.74 nmol/g，其它各处理略高于对照水平（14.97 nmol/g）；喷药3 d后，又回复到处理之前的水平；喷药5 d后，仍然以SNP处理的MDA含量最高，达到34.54 nmol/g，DMTU、MV、L-NNA的MDA含量也略高于对照水平，而STD和ABA处理却导致了顶芽MDA含量低于对照水平；喷药7 d后，除了STD和ABA处理外其它各处理均达到了前所未有的MDA含量水平，STD和ABA处理分别为16.23和18.03 nmol/g，SNP、DMTU、MV和L-NNA的MDA含量依次为47.04、70.58、40.93、46.62 nmol/g。 3 讨论与结论
3.1 活性氧与龙眼成花的关系
活性氧信号在调节植物发育和应对胁迫反应方面具有重要作用，但关于活性氧如何调节花芽分化的报道很少。作为比较稳定的一种活性氧信号分子，H2O2可调节基因的表达，进而调控许多生理过程，包括产生系统抗性、诱导气孔关闭、诱发过敏性反应等[16]。Lokhande等[11]发现，拟南芥开花前的抗坏血酸过氧化物酶活性越高则开花越迟，氧化胁迫越强开花早，即抗坏血酸含量越低，开花越早，抗坏血酸与开花呈负相关，这与本试验结论相同。对于低温胁迫诱导龙眼成花，叶片中抗坏血酸在侧花原基形成时含量上升的原因可能是叶片在此阶段已不需要过多的活性氧来促进花芽形成，而过多的活性氧在侧花原基形成之后阻碍了花序的抽生。顶芽是龙眼花芽分化的发生部位，在遭遇冷胁迫之后，应激性的抗坏血酸含量上升是缓冲顶芽对氧化损伤的反应。而后顶芽启动花芽分化则需要活性氧的累积，抗坏血酸出现下降，并在侧花原基形成之后继续起到抑制顶芽氧化伤害的作用。氧化胁迫较低温胁迫所产生的氧化损伤更为直接，作用部位直接在顶芽组织上，对叶片的影响不大，这与活性氧在龙眼各组织中的分布互相印证。顶芽中抗坏血酸含量的下降预示着氧化胁迫所产生的活性氧将更多的累积于顶芽而无抑制因素的参与。这使得氧化胁迫诱导成花周期较低温诱导更短。这与低温诱导龙眼在末次冬梢成熟后42 d形成侧花原基，而氧化胁迫龙眼在催花之后28 d形成侧花原基互为佐证。
3.2 MDA、抗坏血酸与龙眼成花的关系
MDA与抗坏血酸所表示的氧化损伤意义恰恰相反，如叶片抗坏血酸含量低于顶芽，叶片MDA含量高于顶芽。低温胁迫初期顶芽MDA曾一度高于叶片，可能是启动侧花原基的标志，而后期叶片MDA在侧花原基形成前后的爆发可能是因为顶芽活性氧的下降，使得叶片活性氧向顶芽极性运输所致。NO是动物细胞重要的第二信使，但更多的试验表明，它同时也是植物细胞中一种重要的信号分子，在超氧阴离子的配合下信号分子NO可以转变成具有毒性的亚硝酸根阴离子[17-19]，NO作为信号分子与活性氧协同作用启动植物的应逆反应[20]。Zafra等[21]发现油橄榄成花过程有赖于H2O2和NO的参与。本试验中NO促进剂喷施导致龙眼顶芽MDA含量升高，对龙眼顶芽的损伤较大，但却促进了龙眼早花的出现，这与Zafra的结论相同。
综上所述，氧化损伤与龙眼成花呈正相关，抗坏血酸抑制龙眼成花，而MDA促进龙眼成花。
参考文献
[1] 刘春荣. 温州蜜柑断根和留叶对成花的效应[J]. 福建果树， 1991， 2（1）： 6.
[2] 黄旭明， 陆洁梅， 王惠聪. 氯酸盐在龙眼生产上的应用和研究现状[J]. 中国南方果树， 2004， 31（1）： 62-64.
[3] 张海岚， 吴定尧， 林晓东. 氧化剂催花可使龙眼周年开花着果[J]. 中国南方果树， 2002， 31（1）： 26-27.
[4] Yamada M， Takeno K. Stress and salicylic acid induce the expression of PnFT2 in the regulation of the stress-induced flowering of Pharbitis nil[J]. Journal of Plant Physiology， 2014， 171（3-4）： 205-212.
[5] 陈贵虎， 张云鹏， 蒋建国， 等. 枇杷幼旺树促花技术研究[J]. 西南园艺， 2004， 32（3）： 40-42.
[6] Li X F， Jia L Y， Xu J， et al. FT-like NFT1 gene may play a role in flower transition induced by heat accumulation in Narcissus tazetta var. chinensis[J]. Plant & Cell Physiology， 2013， 54（2）： 270-281.
[7] Su Z， Ma X， Guo H， et al. Flower development under drought stress： morphological and transcriptomic analyses reveal acute responses and long-term acclimation in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2013， 25（10）： 3 785-3 807.
[8] 鲁 勇， 吴楚彬， 陈厚彬， 等. 不同发育时期的荔枝花芽冷敏感性比较[J]. 果树学报， 2013， 30（1）： 115-120.
[9] Li C Y， Weiss D， Goldschmidt E E. Girdling affects carbohydrate-related gene expression in leaves， bark and roots of alternate-bearing citrus trees[J]. Annals of Botany， 2003， 92（1）： 137-143.
[10] Tewari R K， Kumar P， Kim S， et al. Nitric oxide retards xanthine oxidase-mediated superoxide anion generation in Phalaenopsis flower： an implication of NO in the senescence and oxidative stress regulation[J]. Plant Cell Reports， 2009， 28（2）： 267-279. [11] Lokhande S D， Ogawa K， Tanaka A， et al. Effect of temperature on ascorbate peroxidase activity and flowering of Arabidopsis thaliana ecotypes under different light conditions[J]. Journal of Plant Physiology， 2003， 160（1）： 57-64.
[12] Zhou B， Li N， Zhang Z， et al. Hydrogen peroxide and nitric oxide promote reproductive growth in Litchi chinensis[J]. Biologia Plantarum， 56（2）： 321-329.
[13] He Y， Tang R H， Hao Y， et al. Nitric oxide represses the Arabidopsis floral transition[J]. Science， 2004， 305： 1 968-1 971.
[14] 高俊凤. 植物生理学实验技术[M]. 北京： 世界图书出版公司， 2000： 162-163.
[15] 郝建军， 康宗利， 于 洋. 植物生理学实验技术[M]. 北京： 化学工业出版社， 2006： 159-160.
[16] Vanderauwera S， Zimmermann P， Rombauts S， et al. Genome-wide analysis of hydrogen peroxide-regulated gene expression in Arabidopsis reveals a high light-induced transcriptional cluster involved in anthocyanin biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2005， 139（2）： 806-821.
[17] Beligni M V， Lamattina L. Nitric oxide： a non-traditional regulator of plant growth[J]. Trends in Plant Science， 2001， 6（11）： 508-509.
[18] Zhang L， Si J， Zeng F， et al. Molecular cloning and characterization of a ferritin gene upregulated by cold stress in Chorispora bungeana[J]. Biological Trace Element Research， 2009， 128（3）： 269-283.
[19] 吴丽元， 党西强， 何小解，等. 儿茶素清除超氧阴离子对Ang II诱导的内皮祖细胞NO与eNOS表达及凋亡影响[J]. 中国当代儿科杂志， 2009， 11（6）： 476-480.
[20] Del Rio D， Serafini M， Pellegrini N. Selected methodologies to assess oxidative/antioxidant status in vivo： a critical review[J]. Nutrition， Metabolism， and Cardiovascular Diseases， 2002， 12（6）： 343-351.
[21] Zafra A， Rodríguez-García M I， Alché J D. Cellular localization of ROS and NO in olive reproductive tissues during flower development[J]. BMC Plant Biology， 2010， 10： 36.