从乳房内直接采集10家养殖场的生鲜牛乳593份，通过物理和生化方法检测β-内酰胺酶残留情况，并对β-内酰胺酶阳性样品中的主要细菌进行分离培养鉴定，同时测试菌株的药物敏感性，通过统计学方法分析内源性β-内酰胺酶的影响因素。试验结果表明：内源性β-内酰胺酶在生鲜乳中是存在的；正常、隐性乳房炎、休药期和乳房炎4组生鲜乳的阳性率分别是26.4%、30.9%、48.3%、31.1%，平均阳性率是28.7%；分离得到的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯氏菌和链球菌等主要菌种，阳性率分别是65.9%、6.47%、5.9%、4.1%，其中大肠杆菌对3种β-内酰胺类抗生素（氨苄西林、青霉素G和头孢噻呋）的耐药率分别是42.15%、61.98%和40.5%，克雷伯菌对青霉素G和氨苄西林的耐药率分别是100%、60%，提示大肠杆菌和产酸克雷伯菌可能是合成内源性β-内酰胺酶的主要菌种；数据分析显示，菌落总数差异、隐性乳房炎阳性、休药期与否对于β-内酰胺酶阳性结果有显著影响，组间差异、乳房炎与否对于β-内酰胺酶阳性结果无显著影响，隐性乳腺炎阳性率与β-内酰胺酶阳性率无直接相关性。研究对指导健康奶牛养殖、保护奶农利益、指导生鲜乳监督执法、强化乳品质量安全具有重要意义。