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摘要 [目的]研究不同基因型亚麻花粉小孢子离体培养，建立亚麻花粉小孢子离体培养再生体系，以期加快亚麻单倍体育种进程。[方法]以5种不同基因型亚麻的花粉小孢子为外植体，研究不同基因型亚麻愈伤组织诱导率、绿苗的分化率的差异，筛选适宜亚麻花粉小孢子培养基。[结果]不同基因型的亚麻花粉愈伤组织的诱导率、绿苗分化率差异显著，9601和9605愈伤组织的诱导率较高，分别为30.8%和28.6%；9601组合的花粉绿苗分化频率最高为14.5%。其次为9718和9712，分化率分别为11.5%和8.0%；筛选出亚麻花粉小孢子适宜的愈伤组织诱导培养基HF1、绿苗分化培养基HF2。[结论]初步建立了亚麻花粉小孢子离体培养再生体系，为亚麻单倍体育种、突变体筛选、转基因等研究奠定了基础。
关键词 亚麻；基因型；花粉小孢子；克隆
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）31-10873-02
Study on Micro Propagation of Pollen Microspores of Different Genotypes Flax in vitro
SONG Shumin， XIA Zunmin， WANG Xiaonan （Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences， Daqing， Heilongjiang 163319）
Abstract [Objective] The aim was to accelerate breeding course of flax haploid by studying the micro propagation of pollen microspores in vitro and establishing regeneration system of different flax genotypes. [Method] In vitro culture of pollen microspores of five different flax genotypes were conducted by pollen microspores to explore the callus induction rate， seeding regeneration rate and select suitable medium of pollen microspores. [Result] The result showed that there were significant differences in callus induction rate and seeding regeneration rate. Callus induction rates of 9601 and 9605 were higher， 30.8% and 28.6% respectively. The highest seeding regeneration rate of 9601 was 14.5%， followed by 9718 and 9712， 11.5% and 8.0% respectively. HF1 that was suitable inductive medium of callus and HF2 that was medium of seeding regeneration were selected. [Conclusion] The regeneration system of flax pollen microspores was established preliminarily. It provided foundation for haploid breeding， mutant screening and transgene of flax.
Key words Flax； Genotype； Pollen microspores； Clone
亞麻是重要的纤维及油料作物，亚麻纤维具有吸汗、透气性良好和对人体无害等显著特点，越来越受到人类重视。亚麻油含多量不饱和脂肪酸，故用来预防高血脂症和动脉粥样硬化等疾病。因此亚麻具有广阔的发展和应用前景。
我国亚麻花药培养研究始于20世纪70年代，并由我国首次从亚麻花药培养中获得花粉植株，但亚麻花药愈伤组织的诱导率和绿苗分化率很低，且存在大量的从花药壁等组织发育而来的二倍体植株，给单倍体鉴定带来很大困难，严重制约了亚麻单倍体育种进程。
在花药培养基础上开展的游离花粉小孢子培养技术近年来已有长足的进步。游离花粉小孢子培养是把小孢子从花药中分离出来，进行人工培养。花粉小孢子培养具有其独特的优越性。首先，游离花粉是单倍性细胞，游离花粉的培养可减少倍性鉴定的工作量，提高了生产单倍体的效率。其次，它可作为高效的细胞筛选系统，使农艺性状迅速稳定，避免后代的分离。再次，它可作为转基因的受体材料，通过染色体加倍，使外源基因快速纯和。20世纪70年代初，NITSCH等首先报道了烟草的游离小孢子培养。KYO等建立了烟草的游离小孢子高效产生单倍体植株的方法。研究者首次从甘蓝型油菜花药中分离出小孢子并诱导获得小孢子胚和再生植株[1]。研究表明，经预培养，直接培养大麦离体花粉粒，获得了再生植株[2]。但目前关于亚麻游离花粉小孢子培养的研究在国内尚未见报道。
笔者通过研究不同基因型亚麻花粉小孢子愈伤组织诱导及分化的差异，筛选出花粉培养的理想材料；筛选出适宜亚麻花粉小孢子培养的培养基，建立亚麻花粉小孢子离体培养再生体系，以期加快亚麻单倍体育种进程，并为细胞水平的突变体筛选、转基因研究奠定基础。 1 材料与方法
1.1 材料
在黑龙江省科学院大庆分院试验田于6月中下旬采集5种不同基因型的亚麻杂交后代（F1）花粉处于单核中后期的花蕾，材料代号为9601、9605、9712、9715、9718。将花蕾用湿纱布包裹，放入4 ℃左右的冰箱中保存备用。
1.2 培养基
以自行研制的亚麻花培专用培养基HA为基本培养基，愈伤组织诱导培养基为HF1：HA+1.5 mg/L 2.4D+0.5 mg/ L6BA+脯氨酸300 mg/L+蔗糖30 g/L+7 g/L琼脂粉，pH 5.5；亚麻游离花粉愈伤组织分化培养基为HF2：HA+1.5 mg/ L6BA+0.5 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7 g/L琼脂粉，pH5.5；亚麻花粉植株生根培养基为HF3：HA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7 g/L琼脂粉，pH 5.5。
1.3 方法。
1.3.1 外植体表面消毒。
将亚麻花蕾放入3%的次氯酸钠溶液中消毒15 min，再用无菌水冲洗3次，取出花药放入盛有无菌水的培养皿中，用针刺释放法将花粉粒释放到无菌水中，再通过过滤离心收集花粉，制成花粉悬浮液，花粉密度为0.5×102个/ml。
1.3.2 愈伤组织的诱导。
将花粉悬浮液接入诱导培养基，放在20～25 ℃暗培养10 d，再放在20～25 ℃、1 000 lx条件下培养15 d，统计愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率=愈伤组织块数/接种的花粉数×100%。
1.3.3 愈伤组织的分化培养。
当愈伤组织长至5 mm左右时，将其转到分化培養基上。培养温度为25 ℃，光照时间为12 h/d，光强为2 000 lx。20 d后统计愈伤组织的分化率。愈伤组织的分化率=分化绿苗的愈伤组织块数/转入分化培养的愈伤组织数×100%。
1.3.4 生根培养及移栽。
当幼苗长至3～5 cm时转至生根培养基中，培养条件同“1.3.3”。20 d后统计生根率。当根长为2 cm时，打开瓶膜炼苗3 d，用镊子将幼苗从培养基中取出，再用清水洗去根部的培养基，然后栽入花盆中，覆盖塑料膜保湿，5 d后揭去膜。
2 结果与分析
2.1 不同基因型对亚麻花粉愈伤组织诱导的影响
以不同基因型亚麻的花粉小孢子为外植体，共接种5个杂交组合的亚麻花粉悬浮液。每个组合取2 ml花粉悬浮液（花粉密度为5.0×102个/ml）接种至HF1培养基上，进行花粉愈伤组织的诱导，在20～25 ℃、光照强度2 000 lx、光照时间8 h下培养25 d，统计花粉愈伤组织的诱导率。10 d左右花粉愈伤组织陆续出现，结果表明，不同组合亚麻花粉愈伤组织的诱导率差异显著，其中9601、9605组合花粉愈伤组织的诱导率最高，花粉愈伤组织的诱导率分别为30.8%、28.6%。9715的愈伤组织的诱导率相对较低（20.6%）（图1）。
2.4 壮苗及生根
当分化芽长至1～2 cm时，应及时切取并转至壮苗培养基（HA+0.5 mg/L IAA+0.1 mg/L 6BA）中培养，当花粉绿苗长至5 cm左右时，将其转至HF3生根培养基中，在20～25 ℃、光照强度1 000 lx、光照时间8 h下培养，亚麻花粉绿苗的生根率达95.2%以上。
3 小结与讨论
（1）亚麻不同基因型影响其再生能力。不同基因型亚麻花粉愈伤组织的诱导率和绿苗再生频率差异较大。该研究共用了5种基因型的亚麻进行花粉培养，其中9601组合的花粉愈伤组织的诱导率、花粉绿苗再生频率最高，9601可作为亚麻花粉培养的理想供试材料。
（2）诱导培养基中加入2，4D对诱导花粉愈伤组织十分必要，但2，4D的用量超过2 mg/L时，获得愈伤组织的绿苗分化能力降低。
（3）
培养温度是影响亚麻花粉愈伤组织质量的主要因素，诱导愈伤组织阶段培养温度不宜超过30 ℃。培养温度超过30 ℃，易产生松脆、水渍状的愈伤组织，这种愈伤组织极不宜分化，即使分化，分化出的玻璃苗较多。
（4）该研究初步建立了亚麻花粉小孢子培养再生体系。花粉小孢子培养体系的建立为在细胞水平上进一步进行亚麻单倍体育种奠定了基础。今后还要对亚麻花粉小孢子培养体系进行不断完善，使亚麻花粉小孢子培养在细胞突变体筛选、转基因等领域得到更广泛的应用。
参考文献
[1]
肖尊安.植物生物技术[M].北京：化学工业出版社，2005：106-107.
[2] 颜昌敬.农作物组织培养[M].上海：上海科学技术出版社，1991：255-256.
关键词 亚麻；基因型；花粉小孢子；克隆
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）31-10873-02
Study on Micro Propagation of Pollen Microspores of Different Genotypes Flax in vitro
SONG Shumin， XIA Zunmin， WANG Xiaonan （Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences， Daqing， Heilongjiang 163319）
Abstract [Objective] The aim was to accelerate breeding course of flax haploid by studying the micro propagation of pollen microspores in vitro and establishing regeneration system of different flax genotypes. [Method] In vitro culture of pollen microspores of five different flax genotypes were conducted by pollen microspores to explore the callus induction rate， seeding regeneration rate and select suitable medium of pollen microspores. [Result] The result showed that there were significant differences in callus induction rate and seeding regeneration rate. Callus induction rates of 9601 and 9605 were higher， 30.8% and 28.6% respectively. The highest seeding regeneration rate of 9601 was 14.5%， followed by 9718 and 9712， 11.5% and 8.0% respectively. HF1 that was suitable inductive medium of callus and HF2 that was medium of seeding regeneration were selected. [Conclusion] The regeneration system of flax pollen microspores was established preliminarily. It provided foundation for haploid breeding， mutant screening and transgene of flax.
Key words Flax； Genotype； Pollen microspores； Clone
亞麻是重要的纤维及油料作物，亚麻纤维具有吸汗、透气性良好和对人体无害等显著特点，越来越受到人类重视。亚麻油含多量不饱和脂肪酸，故用来预防高血脂症和动脉粥样硬化等疾病。因此亚麻具有广阔的发展和应用前景。
我国亚麻花药培养研究始于20世纪70年代，并由我国首次从亚麻花药培养中获得花粉植株，但亚麻花药愈伤组织的诱导率和绿苗分化率很低，且存在大量的从花药壁等组织发育而来的二倍体植株，给单倍体鉴定带来很大困难，严重制约了亚麻单倍体育种进程。
在花药培养基础上开展的游离花粉小孢子培养技术近年来已有长足的进步。游离花粉小孢子培养是把小孢子从花药中分离出来，进行人工培养。花粉小孢子培养具有其独特的优越性。首先，游离花粉是单倍性细胞，游离花粉的培养可减少倍性鉴定的工作量，提高了生产单倍体的效率。其次，它可作为高效的细胞筛选系统，使农艺性状迅速稳定，避免后代的分离。再次，它可作为转基因的受体材料，通过染色体加倍，使外源基因快速纯和。20世纪70年代初，NITSCH等首先报道了烟草的游离小孢子培养。KYO等建立了烟草的游离小孢子高效产生单倍体植株的方法。研究者首次从甘蓝型油菜花药中分离出小孢子并诱导获得小孢子胚和再生植株[1]。研究表明，经预培养，直接培养大麦离体花粉粒，获得了再生植株[2]。但目前关于亚麻游离花粉小孢子培养的研究在国内尚未见报道。
笔者通过研究不同基因型亚麻花粉小孢子愈伤组织诱导及分化的差异，筛选出花粉培养的理想材料；筛选出适宜亚麻花粉小孢子培养的培养基，建立亚麻花粉小孢子离体培养再生体系，以期加快亚麻单倍体育种进程，并为细胞水平的突变体筛选、转基因研究奠定基础。 1 材料与方法
1.1 材料
在黑龙江省科学院大庆分院试验田于6月中下旬采集5种不同基因型的亚麻杂交后代（F1）花粉处于单核中后期的花蕾，材料代号为9601、9605、9712、9715、9718。将花蕾用湿纱布包裹，放入4 ℃左右的冰箱中保存备用。
1.2 培养基
以自行研制的亚麻花培专用培养基HA为基本培养基，愈伤组织诱导培养基为HF1：HA+1.5 mg/L 2.4D+0.5 mg/ L6BA+脯氨酸300 mg/L+蔗糖30 g/L+7 g/L琼脂粉，pH 5.5；亚麻游离花粉愈伤组织分化培养基为HF2：HA+1.5 mg/ L6BA+0.5 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7 g/L琼脂粉，pH5.5；亚麻花粉植株生根培养基为HF3：HA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7 g/L琼脂粉，pH 5.5。
1.3 方法。
1.3.1 外植体表面消毒。
将亚麻花蕾放入3%的次氯酸钠溶液中消毒15 min，再用无菌水冲洗3次，取出花药放入盛有无菌水的培养皿中，用针刺释放法将花粉粒释放到无菌水中，再通过过滤离心收集花粉，制成花粉悬浮液，花粉密度为0.5×102个/ml。
1.3.2 愈伤组织的诱导。
将花粉悬浮液接入诱导培养基，放在20～25 ℃暗培养10 d，再放在20～25 ℃、1 000 lx条件下培养15 d，统计愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率=愈伤组织块数/接种的花粉数×100%。
1.3.3 愈伤组织的分化培养。
当愈伤组织长至5 mm左右时，将其转到分化培養基上。培养温度为25 ℃，光照时间为12 h/d，光强为2 000 lx。20 d后统计愈伤组织的分化率。愈伤组织的分化率=分化绿苗的愈伤组织块数/转入分化培养的愈伤组织数×100%。
1.3.4 生根培养及移栽。
当幼苗长至3～5 cm时转至生根培养基中，培养条件同“1.3.3”。20 d后统计生根率。当根长为2 cm时，打开瓶膜炼苗3 d，用镊子将幼苗从培养基中取出，再用清水洗去根部的培养基，然后栽入花盆中，覆盖塑料膜保湿，5 d后揭去膜。
2 结果与分析
2.1 不同基因型对亚麻花粉愈伤组织诱导的影响
以不同基因型亚麻的花粉小孢子为外植体，共接种5个杂交组合的亚麻花粉悬浮液。每个组合取2 ml花粉悬浮液（花粉密度为5.0×102个/ml）接种至HF1培养基上，进行花粉愈伤组织的诱导，在20～25 ℃、光照强度2 000 lx、光照时间8 h下培养25 d，统计花粉愈伤组织的诱导率。10 d左右花粉愈伤组织陆续出现，结果表明，不同组合亚麻花粉愈伤组织的诱导率差异显著，其中9601、9605组合花粉愈伤组织的诱导率最高，花粉愈伤组织的诱导率分别为30.8%、28.6%。9715的愈伤组织的诱导率相对较低（20.6%）（图1）。
2.4 壮苗及生根
当分化芽长至1～2 cm时，应及时切取并转至壮苗培养基（HA+0.5 mg/L IAA+0.1 mg/L 6BA）中培养，当花粉绿苗长至5 cm左右时，将其转至HF3生根培养基中，在20～25 ℃、光照强度1 000 lx、光照时间8 h下培养，亚麻花粉绿苗的生根率达95.2%以上。
3 小结与讨论
（1）亚麻不同基因型影响其再生能力。不同基因型亚麻花粉愈伤组织的诱导率和绿苗再生频率差异较大。该研究共用了5种基因型的亚麻进行花粉培养，其中9601组合的花粉愈伤组织的诱导率、花粉绿苗再生频率最高，9601可作为亚麻花粉培养的理想供试材料。
（2）诱导培养基中加入2，4D对诱导花粉愈伤组织十分必要，但2，4D的用量超过2 mg/L时，获得愈伤组织的绿苗分化能力降低。
（3）
培养温度是影响亚麻花粉愈伤组织质量的主要因素，诱导愈伤组织阶段培养温度不宜超过30 ℃。培养温度超过30 ℃，易产生松脆、水渍状的愈伤组织，这种愈伤组织极不宜分化，即使分化，分化出的玻璃苗较多。
（4）该研究初步建立了亚麻花粉小孢子培养再生体系。花粉小孢子培养体系的建立为在细胞水平上进一步进行亚麻单倍体育种奠定了基础。今后还要对亚麻花粉小孢子培养体系进行不断完善，使亚麻花粉小孢子培养在细胞突变体筛选、转基因等领域得到更广泛的应用。
参考文献
[1]
肖尊安.植物生物技术[M].北京：化学工业出版社，2005：106-107.
[2] 颜昌敬.农作物组织培养[M].上海：上海科学技术出版社，1991：255-256.