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【摘要】 目的 研究鞘内注射丙戊茶碱对完全弗氏佐剂致大鼠炎症模型的热痛觉过敏的影响，探讨脊髓背角的星形胶质细胞及前炎症因子在炎症痛中的可能作用。方法SD大鼠32只，随机分为4组，每组8只，热辐射法测定各组热缩足反射潜伏期。结果 模型组第二天出现明显的炎症，热缩足反射潜伏期较明显缩短(P<0.05)，鞘内注射丙戊茶碱5h可观察到大鼠的热缩足反射潜伏期明显延长(P<0.05)，2）：治疗组与模型组中大鼠脊髓L5星形胶质细胞GFAP染色比较，前者染色变浅，分支缩短，积分光密度值下降(P<0.01)。 结论 脊髓星形胶质细胞参与炎症痛的维持，丙戊茶碱可能通过抑制星形胶质细胞的活化，从而减少前炎症因子的分泌而发挥抗伤害作用。
【关键词】 丙戊茶碱；佐剂性关节炎；星形胶质细胞；热痛觉过敏；
The antinociceptive mechanism of in trathecal administration of propentofylline in a rat model of inflammatory
ZHANG Yan-bing, CHENG Hao, WANG Li-na, YANG Jian-ping.
﹙Dept of Anesthesiology.The First Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215006, China﹚
【Abstract】 Objective To investigate whether propentofylline could attenuate existing heat hyperalgesia, and detected the effect of propentofylline on the activation of glia in the lumbar spinal cord using a rat model of Complete Freunds Adjuvant (CFA)-induced peripheral inflammatory pain. Methods 32♂ SD rats (180-220 g) were randomly divided into 4 groups (n=8 each). Measure the change of TWL in the following 24 hours after CFA subcutaneous injected. The change of GFAP expression in L5 segments of spinal cord was accessed by immunohistochemistry analysis. Results CFA produced marked inflammation and thermal hyperalgesia in the injected paw. Propentofylline had no effect on the TWL of sham group, but the TWL of right hind paw was significantly higher in therapy group (P<0.05). Conclusion, astrocytes are activated, propentofylline have anti-nociceptive property in this inflammatory pain amodel. The anti-nociceptive effect of propentofylline was associated with its ability to suppress astrocytes activation and inflammatory responses at the lumbar spinal cord.
【key words】 Propentofylline, Adjuvanticity arthritis, Astrocyte, Thermal hyperalgesia
外伤，手术等导致的神经损伤、炎症刺激均可引起神经元的可塑性改变从而产生疼痛，最近研究表明胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）在痛觉易化过程中同样发挥着极其重要的作用[1,]。本实验观察完全弗氏佐剂性关节炎大鼠脊髓星形胶质细胞的活化情况、鞘内注射丙戊茶碱（propentofylline, PPF）对大鼠热痛敏以及对腰5脊髓节段胶质细胞活化、炎症细胞因子表达的影响。以探求炎症性热痛觉过敏中星形胶质细胞的可能作用机制,为临床疼痛治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物选择：取体重180～220g♂SD大鼠32只（由苏州大学医学院实验动物研究中心提供，清洁Ⅱ级，使用许可证号：syxk2002-0037），单笼饲养。室温为23±3℃，周期光照8：00～20：00，所有实验均在光照期间完成。大鼠在戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下蛛网膜下腔置入微导管[2]，置管4～5d (天)后进行行为学测试，有肢瘫或导管脱出者予以剔除。所有大鼠在行为学测试前连续3d放于有机玻璃测试箱中使大鼠适应环境和观察人员。
1.2 实验药物：完全弗氏佐剂（Complete Freunds Adjuvant，CFA, Lot F5881, sigma公司）；丙戊茶碱 （propentofylline, PPF，粉剂，Lot P9689，美国sigma公司)；兔抗大鼠胶原纤维酸性蛋白（anti-glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体(sigma，美国)；SP-9001试剂盒及DAB(Santa Cruz)，ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司) 。丙戊茶碱使用前用0.01%PBS稀释为1g/L。丙戊茶碱鞘内注射（i.t.），1次/天，注射后加注12μl NS 冲洗导管。BME-410A型热辐射刺激仪购自中国医学科学院生物医学研究所。
1.3 实验分组：32只大鼠随机平分为4组：生理盐水组：鞘内注射生理盐水加皮下注射生理盐水；模型组：鞘内注射生理盐水加皮下注射弗氏佐剂；单用丙戊茶碱组：鞘内注射丙戊茶碱加皮下注射生理盐水；丙午茶碱治疗组：皮下注射弗氏佐剂加鞘内注射丙戊茶碱（n=8）。
1.4 行为学测试：将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，大鼠在有机玻璃箱中适应30min（分钟）后，按照Hargreaves法[3]测大鼠热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency, TWL）为其痛阈指标，即照射开始至大鼠出现抬腿回避的时间(s)。用BME-410型热辐射刺激仪（10V，30W，光斑直径0.5cm）照射大鼠足底皮肤。切断时间为30 s，以防止组织损伤。超过30 s者以30 s为其痛阈。每只动物测定3次，每次间隔6～8min，取其平均值。如有大鼠的TWL值不稳定给予舍弃。
1.5 统计方法 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS12.0统计软件包进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P <0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异非常显著的意义。
2 结果
2.1 NS和CFA对大鼠TWL的影响：大鼠皮下及鞘内注射生理盐水后热缩足反射潜伏期无显著差异(P>0.05)。注射CFA后大鼠注射侧产生显著的炎症反应（水肿和红斑）及热痛觉过敏。3 h已很明显，9h左右达到高峰，持续24h基本不变，此后逐渐恢复。踝关节注射CFA后每天鞘内注射NS大鼠炎症侧热缩足反射潜伏期无显著改变（P>0.05）。
2.2 鞘内注射丙戊茶碱对正常大鼠TWL影响：Ⅲ组大鼠双侧肢体的TWL在整个实验过程中与基础值比较没有明显的改变（P>0.05）。
2.3 鞘内注射丙戊茶碱对炎性痛大鼠TWL影响：鞘内注射丙戊茶碱后5h，治疗组大鼠TWL与给药前比较有显著增高（P<0.001）。
3 讨论
创伤、手术后病人因组织损伤，炎症等引起的持续性疼痛常常伴随痛觉过敏的出现，严重影响病人的康复和正常生活。在痛觉产生及其机理的研究中，已经建立了较好的动物模型，其中在病理性痛模型中对胶质细胞作用机制的探讨较多，而在炎症痛模型中星形胶质细胞是否参与疼痛研究和探讨则较少，外周炎症能否激活中枢胶质细胞的活化意见不一，如Reghavendra等[5]在外周注射CFA，观察到星形胶质细胞和小胶质细胞活化标志均有表达增多，其他实验室[1,8]在类似实验中却没有观察到或仅观察到较弱强度的变化。本实验采用大鼠踝关节外侧皮下注射CFA，形成病灶较为局限，炎症强度相对较轻的单侧佐剂性关节炎疼痛模型，造模后炎症痛组大鼠热反射潜伏期降低，注射后9h达到高峰，并且高峰可以持续2d，分期明显，易于观察和评估。
本实验通过大鼠鞘内注射丙戊茶碱观察其抗伤害性作用及探讨其作用可能通过抑制脊髓部位星形胶质细胞活化来实现。结果发现外周皮下注射CFA可产生明显炎症反应，同时脊髓背角浅层星形胶质细胞活化，鞘内注射丙戊茶碱可显著抑制CFA诱发的热痛觉过敏，在炎症产生后1d～6d内鞘内注射丙戊茶碱均使大鼠TWL显著提高，说明星形胶质细胞可能在炎症痛的维持中发挥重要作用。
丙戊茶碱是一种甲基黄嘌呤的衍生物，目前作为改善脑血管功能的药物已进入临床实验阶段。实验证实，在神经病理性痛动物模型，丙戊茶碱可抑制胶质细胞活化而产生抗伤害性刺激作用[3]。实验中鞘内注射丙戊茶碱对正常大鼠的热缩足反射潜伏期无明显变化，而显著抑制了致炎大鼠的热痛觉过敏，明显改善了大鼠的痛行为。它抑制星形胶质细胞机制可能通过抑制环磷酸腺苷分解的磷酸二酯酶亚型Ⅳ增加细胞内的环磷酸腺苷来发挥作用。故丙戊茶碱可能通过调节脊髓星形胶质细胞活化而发挥抗伤害性作用。
综上所述，大鼠踝关节外侧皮下注射CFA可以导致脊髓部位的星形胶质细胞持续活化，鞘内注射丙戊茶碱显著抑制脊髓星形胶质细胞的活化，缓解佐剂性关节炎的热痛觉过敏。因此，大鼠脊髓星形胶质细胞在炎症性疼痛和痛觉过敏的产生和维持中发挥着重要作用。
参考文献
［1］McMahon SB, Cafferty WB, Marchand F. Immune and glial cell factors as pain mediatord and modulators. Exp Neuro, 2005, 192 (2): 444-462.
［2］Storkson RV, Kjorsvik A, Tjolsen A, et al. Lumbar catheterization of thespinal subarachnoid space in the rat. J Neurosci Methods, 1996, 65 (2): 167-172.
［3］Hargreaves K, Dubner R, Brown F. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain, 1988, 32 (1): 77-88.
［4］Ruda MA, ladarola MJ, Cohen LV, et al.In situ hybridization histochemistry and immunocytochemistry reveal an increase in spinal dynorphin biosynthesis in a rat model of peripheral information and hyperalgesia. J Proc Natl Acad SCI. 1988, 85 (2): 622-626.
［5］Meskini N, Nemoz G, Olyayuz-Baklouti I, et al. Phosphodiesterase inhibitory profile of some related xanthine derivatives pharmacologically active on the peripheral microcirculation.Biochem Pharmacol. 1994, 47: 781-788.
通讯作者：杨建平
【关键词】 丙戊茶碱；佐剂性关节炎；星形胶质细胞；热痛觉过敏；
The antinociceptive mechanism of in trathecal administration of propentofylline in a rat model of inflammatory
ZHANG Yan-bing, CHENG Hao, WANG Li-na, YANG Jian-ping.
﹙Dept of Anesthesiology.The First Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215006, China﹚
【Abstract】 Objective To investigate whether propentofylline could attenuate existing heat hyperalgesia, and detected the effect of propentofylline on the activation of glia in the lumbar spinal cord using a rat model of Complete Freunds Adjuvant (CFA)-induced peripheral inflammatory pain. Methods 32♂ SD rats (180-220 g) were randomly divided into 4 groups (n=8 each). Measure the change of TWL in the following 24 hours after CFA subcutaneous injected. The change of GFAP expression in L5 segments of spinal cord was accessed by immunohistochemistry analysis. Results CFA produced marked inflammation and thermal hyperalgesia in the injected paw. Propentofylline had no effect on the TWL of sham group, but the TWL of right hind paw was significantly higher in therapy group (P<0.05). Conclusion, astrocytes are activated, propentofylline have anti-nociceptive property in this inflammatory pain amodel. The anti-nociceptive effect of propentofylline was associated with its ability to suppress astrocytes activation and inflammatory responses at the lumbar spinal cord.
【key words】 Propentofylline, Adjuvanticity arthritis, Astrocyte, Thermal hyperalgesia
外伤，手术等导致的神经损伤、炎症刺激均可引起神经元的可塑性改变从而产生疼痛，最近研究表明胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）在痛觉易化过程中同样发挥着极其重要的作用[1,]。本实验观察完全弗氏佐剂性关节炎大鼠脊髓星形胶质细胞的活化情况、鞘内注射丙戊茶碱（propentofylline, PPF）对大鼠热痛敏以及对腰5脊髓节段胶质细胞活化、炎症细胞因子表达的影响。以探求炎症性热痛觉过敏中星形胶质细胞的可能作用机制,为临床疼痛治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物选择：取体重180～220g♂SD大鼠32只（由苏州大学医学院实验动物研究中心提供，清洁Ⅱ级，使用许可证号：syxk2002-0037），单笼饲养。室温为23±3℃，周期光照8：00～20：00，所有实验均在光照期间完成。大鼠在戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下蛛网膜下腔置入微导管[2]，置管4～5d (天)后进行行为学测试，有肢瘫或导管脱出者予以剔除。所有大鼠在行为学测试前连续3d放于有机玻璃测试箱中使大鼠适应环境和观察人员。
1.2 实验药物：完全弗氏佐剂（Complete Freunds Adjuvant，CFA, Lot F5881, sigma公司）；丙戊茶碱 （propentofylline, PPF，粉剂，Lot P9689，美国sigma公司)；兔抗大鼠胶原纤维酸性蛋白（anti-glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体(sigma，美国)；SP-9001试剂盒及DAB(Santa Cruz)，ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司) 。丙戊茶碱使用前用0.01%PBS稀释为1g/L。丙戊茶碱鞘内注射（i.t.），1次/天，注射后加注12μl NS 冲洗导管。BME-410A型热辐射刺激仪购自中国医学科学院生物医学研究所。
1.3 实验分组：32只大鼠随机平分为4组：生理盐水组：鞘内注射生理盐水加皮下注射生理盐水；模型组：鞘内注射生理盐水加皮下注射弗氏佐剂；单用丙戊茶碱组：鞘内注射丙戊茶碱加皮下注射生理盐水；丙午茶碱治疗组：皮下注射弗氏佐剂加鞘内注射丙戊茶碱（n=8）。
1.4 行为学测试：将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，大鼠在有机玻璃箱中适应30min（分钟）后，按照Hargreaves法[3]测大鼠热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency, TWL）为其痛阈指标，即照射开始至大鼠出现抬腿回避的时间(s)。用BME-410型热辐射刺激仪（10V，30W，光斑直径0.5cm）照射大鼠足底皮肤。切断时间为30 s，以防止组织损伤。超过30 s者以30 s为其痛阈。每只动物测定3次，每次间隔6～8min，取其平均值。如有大鼠的TWL值不稳定给予舍弃。
1.5 统计方法 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS12.0统计软件包进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P <0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异非常显著的意义。
2 结果
2.1 NS和CFA对大鼠TWL的影响：大鼠皮下及鞘内注射生理盐水后热缩足反射潜伏期无显著差异(P>0.05)。注射CFA后大鼠注射侧产生显著的炎症反应（水肿和红斑）及热痛觉过敏。3 h已很明显，9h左右达到高峰，持续24h基本不变，此后逐渐恢复。踝关节注射CFA后每天鞘内注射NS大鼠炎症侧热缩足反射潜伏期无显著改变（P>0.05）。
2.2 鞘内注射丙戊茶碱对正常大鼠TWL影响：Ⅲ组大鼠双侧肢体的TWL在整个实验过程中与基础值比较没有明显的改变（P>0.05）。
2.3 鞘内注射丙戊茶碱对炎性痛大鼠TWL影响：鞘内注射丙戊茶碱后5h，治疗组大鼠TWL与给药前比较有显著增高（P<0.001）。
3 讨论
创伤、手术后病人因组织损伤，炎症等引起的持续性疼痛常常伴随痛觉过敏的出现，严重影响病人的康复和正常生活。在痛觉产生及其机理的研究中，已经建立了较好的动物模型，其中在病理性痛模型中对胶质细胞作用机制的探讨较多，而在炎症痛模型中星形胶质细胞是否参与疼痛研究和探讨则较少，外周炎症能否激活中枢胶质细胞的活化意见不一，如Reghavendra等[5]在外周注射CFA，观察到星形胶质细胞和小胶质细胞活化标志均有表达增多，其他实验室[1,8]在类似实验中却没有观察到或仅观察到较弱强度的变化。本实验采用大鼠踝关节外侧皮下注射CFA，形成病灶较为局限，炎症强度相对较轻的单侧佐剂性关节炎疼痛模型，造模后炎症痛组大鼠热反射潜伏期降低，注射后9h达到高峰，并且高峰可以持续2d，分期明显，易于观察和评估。
本实验通过大鼠鞘内注射丙戊茶碱观察其抗伤害性作用及探讨其作用可能通过抑制脊髓部位星形胶质细胞活化来实现。结果发现外周皮下注射CFA可产生明显炎症反应，同时脊髓背角浅层星形胶质细胞活化，鞘内注射丙戊茶碱可显著抑制CFA诱发的热痛觉过敏，在炎症产生后1d～6d内鞘内注射丙戊茶碱均使大鼠TWL显著提高，说明星形胶质细胞可能在炎症痛的维持中发挥重要作用。
丙戊茶碱是一种甲基黄嘌呤的衍生物，目前作为改善脑血管功能的药物已进入临床实验阶段。实验证实，在神经病理性痛动物模型，丙戊茶碱可抑制胶质细胞活化而产生抗伤害性刺激作用[3]。实验中鞘内注射丙戊茶碱对正常大鼠的热缩足反射潜伏期无明显变化，而显著抑制了致炎大鼠的热痛觉过敏，明显改善了大鼠的痛行为。它抑制星形胶质细胞机制可能通过抑制环磷酸腺苷分解的磷酸二酯酶亚型Ⅳ增加细胞内的环磷酸腺苷来发挥作用。故丙戊茶碱可能通过调节脊髓星形胶质细胞活化而发挥抗伤害性作用。
综上所述，大鼠踝关节外侧皮下注射CFA可以导致脊髓部位的星形胶质细胞持续活化，鞘内注射丙戊茶碱显著抑制脊髓星形胶质细胞的活化，缓解佐剂性关节炎的热痛觉过敏。因此，大鼠脊髓星形胶质细胞在炎症性疼痛和痛觉过敏的产生和维持中发挥着重要作用。
参考文献
［1］McMahon SB, Cafferty WB, Marchand F. Immune and glial cell factors as pain mediatord and modulators. Exp Neuro, 2005, 192 (2): 444-462.
［2］Storkson RV, Kjorsvik A, Tjolsen A, et al. Lumbar catheterization of thespinal subarachnoid space in the rat. J Neurosci Methods, 1996, 65 (2): 167-172.
［3］Hargreaves K, Dubner R, Brown F. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain, 1988, 32 (1): 77-88.
［4］Ruda MA, ladarola MJ, Cohen LV, et al.In situ hybridization histochemistry and immunocytochemistry reveal an increase in spinal dynorphin biosynthesis in a rat model of peripheral information and hyperalgesia. J Proc Natl Acad SCI. 1988, 85 (2): 622-626.
［5］Meskini N, Nemoz G, Olyayuz-Baklouti I, et al. Phosphodiesterase inhibitory profile of some related xanthine derivatives pharmacologically active on the peripheral microcirculation.Biochem Pharmacol. 1994, 47: 781-788.
通讯作者：杨建平