【背景和目的】胃癌(gastric cancer,GC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,并且是亚洲地区引起癌性死亡的第二大病因。根据Lauren分型,胃癌分为弥漫型胃癌(diffuse-type gastric cancer,DGC)和肠型胃癌两种胃癌类型;DGC也叫做低分化胃癌。虽然精准医疗在临床上大力拓展,但是仍缺乏可靠的早期预测标志物及抑制肿瘤转移的治疗靶点,DGC的发病率和死亡率反而逐年上升,5年生存率不到10%-20%,并且常见于年轻的病人。DGC因更强的侵袭性和转移性使其成为预后最差的胃癌类型。已有大量研究证明许多致癌基因和抑癌基因参与到DGC的发生发展,但是其侵袭和转移的具体作用机制却不清楚。因此,针对DGC的侵袭和转移分子机制探讨,寻找潜在的早期诊断标准和治疗靶点,对DGC患者具有十分重大的临床意义。随着高通量测序和新一代基因芯片技术的发展,长链非编码RNA(long non-codingRNA,lncRNA)在基因组中发现存在着大量的转录。lncRNA不同于编码基因,其是长度超过200个核苷酸序列但是没有编码蛋白的能力,通过在转录和转录后水平调节基因的表达。近来研究表明lncRNA在细胞增殖、分化、凋亡和细胞周期等细胞调控中发挥着重要的作用。越来越多的研究发现lncRNA参与到肿瘤生物学功能的各个环节,包括增殖、变异、细胞周期、侵袭和转移等。这也使得异常表达的lncRNA在肿瘤的诊断和预后,药物靶点的研究成为了热点。然而,lncRNA在肿瘤中的作用机制仍然不清楚,尚处于早期研究阶段。LncRNA RP11-357H14.17定位于17q21.32,在肿瘤中的作用国内外尚未报道,所以对其在DGC中的功能及作用机制知之甚少。为了探讨LncRNA RP11-357H14.17在DGC中的生物作用及侵袭转移的机制,我们将本课题分为三个部分进行研究。首先通过高通量测序筛选并验证LncRNA RP11-357H14.17在DGC中异常表达,其次结合临床病理特征探讨LncRNA RP11-357H14.17的临床价值,再通过体内外功能试验探讨LncRNA RP11-357H14.17对DGC生物学功能的影响,最后对其促进DGC侵袭和转移机制进行初步的研究。第一部分弥漫型胃癌LncRNA的筛选及验证【研究方法】1、临床标本选取,收集临床诊断为低分化胃癌的6例患者癌组织及其癌旁正常胃粘膜标本。2、采用高通量测序检测分析6例弥漫型胃癌患者的癌组织和癌旁正常胃粘膜组织中lncrna的表达情况。3、分析测序中lncrna的表达情况,利用分层聚类分析筛选出明显异常表达的lncrna。4、临床接着选取符合条件的42例弥漫型胃癌患者进行qrt-pcr检测,对lncrnarp11-357h14.17的表达水平进一步验证。【结果】1、高通量测序结果显示,将foldchange≥2且p-value<0.05作为筛选标准,在肿瘤组相对于正常组,共发现了112个差异表达的lncrna,其中73个lncrna表达上调,39个lncrna表达下调。其中包括71个lincrna(18个下调,53个上调),30个anti-senselncrna(16个下调,14个上调),11个introniclncrna(5个下调,6个上调)。2、分层聚类法来分析高通量测序中异常表达的lncrna,筛选出明显异常表达的10个lncrna。我们进一步将foldchange≥8且p-value<0.05,并且将表达升高作为10个lncrna的筛选标准,发现了xist,pvt1和rp11-357h14.17三个lncrna符合标准,其中xist和pvt1已被报道在胃癌中高表达,这也证明了我们的测序结果和筛选标准的可靠性。随后实验我们将rp11-357h14.17作为研究对象。3、qrt-pcr检测结果显示在42例弥漫型胃癌患者中,lncrnarp11-357h14.17相对表达升高的有32个,相对表达降低的有10个。在对比正常胃粘膜组织中,lncrnarp11-357h14.17的表达水平明显升高(p<0.05)。qrt-pcr检测结果和测序结果具有相同趋势,为下一步rp11-357h14.17在弥漫型胃癌中的功能研究打下基础。第二部分lncrnarp11-357h14.17病理学特征及对弥漫型胃癌生物学功能的探讨【研究方法】1、结合临床病理资料对lncrnarp11-357h14.17进行分析,分析其与弥漫型胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度、淋巴转移和tnm分期的相关性。2、利用qrt-pcr技术检测lncrnarp11-357h14.17在5株胃癌细胞株(高分化ags、中分化sgc-7901、低分化mkn-45和mgc-803、正常胃粘膜ges-1)中的表达情况。3、利用si-rna技术,制备和包装si-rp11-357h14.17病毒,用si-rp11-357h14.17病毒转染弥漫型胃癌细胞株mgc-803和mkn-45,下调lncrnarp11-357h14.17在细胞株中的表达。4、建立实验分组,正常目的细胞组(con)、正常加阴性对照病毒感染的目的细胞组(nc)、正常加lncrna目的基因病毒感染的目的细胞组(kd)。5、mtt、克隆形成实验检测3组实验细胞的增殖和生长情况。6、流式细胞仪检测3组实验细胞的细胞周期和凋亡率。7、划痕实验检测、transwell小室实验检测3组实验细胞的侵袭和迁移能力。8、裸鼠皮下荷瘤实验检测下调lncrnarp11-357h14.17对胃癌的影响。【结果】1、在弥漫型胃癌患者中,胃癌组织中lncrnarp11-357h14.17的表达与患者的年龄、性别无明显相关性(p>0.05),而与肿瘤大小、浸润深度、淋巴转移和tnm分期相关(p<0.05)。2、qrt-pcr技术检测rp11-357h14.17在胃癌细胞株的表达结果显示:rp11-357h14.17在胃癌细胞株mgc-803、mkn-45、sgc-7901、ags中的表达量明显高于正常胃粘膜细胞株ges-1中表达量(p<0.05)。差异具有统计学意义。而在胃癌细胞株mgc-803、mkn-45、sgc-7901、ags相对于正常胃粘膜细胞株ges-1中mgc-803的表达量最高,mkn-45第二。而mgc-803和mkn-45属于弥漫型胃癌细胞株,这就与rp11-357h14.17在弥漫型胃癌组织中高表达相符合。确定了我们研究的可行性和下一步研究的细胞株。3、成功制备和包装si-rp11-357h14.17病毒,用si-rp11-357h14.17病毒转染弥漫型胃癌细胞株mgc-803和mkn-45。通过qrt-pcr技术检测mgc-803和mkn-45细胞中敲减效率,相对于对照组nc,si-rp11-357h14.17组lncrna基因敲减效率达到42.8%,差异具有统计学意义(p<0.05)。4、mtt结果显示:正常加lncrna目的基因病毒感染的目的细胞组(kd)与对照组nc和正常目的细胞组con相比在加入mtt第4天对波长490nm的光的吸收率显著降低,且随时间变化,差异更明显,具有统计学意义(p<0.05)。克隆形成实验结果表明:在mgc-803和mkn-45细胞中,sirna慢病毒感染12天后,相对于对照con和nc组,si-rp11-357h14.17组细胞克隆形成计数结果无明显变化(p>0.05),无统计学意义。5、流式细胞仪结果表明:细胞周期实验中,相对于对照组nc,si-rp11-357h14.1组的rp11-357h14.17在s和g2/m期的细胞比例显著升高,在g1期的细胞比例显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。细胞凋亡实验中,在侵袭小室内孵育24h后,相对于对照组con和nc组,si-rp11-357h14.17组中细胞转移的数量明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。6、划痕试验结果显示:在24小时时,si-rp11-357h14.17组中穿透膜的细胞数量与con组相比数量明显减少,具有统计学意义(p<0.05)。侵袭实验结果显示:在侵袭小室内孵育24h后,相对于对照组con和nc组,si-rp11-357h14.17组中细胞转移的数量明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。7、裸鼠皮下荷瘤实验检测结果显示:相对于空白对照组,si-RP11-357H14.17组肿瘤显著缩小,差异具有统计学意义(P<0.05)。第三部分LncRNA RP11-357H14.17促进弥漫型胃癌侵袭和转移的初步机制研究【研究方法】1、通过siRNA干扰技术,用si-RP11-357H14.17病毒转染弥漫型胃癌细胞株MGC-803和MKN-45,降低lncRNA RP11-357H14.17在细胞株MGC-803和MKN-45中的表达。2、建立实验分组,正常目的细胞组(NC)和正常加lncRNA目的基因病毒感染的目的细胞组(KD)3、利用qRT-PCR技术检测2组细胞中EMT的标记物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达情况。4、通过免疫印迹法(WB)检测2组细胞中EMT的标记物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达情况。【结果】1、qRT-PCR技术检测结果显示:相对于对照组NC组,si-lncRNA组低表达的RP11-357H14.17在MGC-803和MKN45细胞株中E-cadherin和N-cadherin表达水平显著升高,Vimentin的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。2、免疫印迹法(WB)检测结果显示:相对于对照组NC组,si-lncRNA组低表达的RP11-357H14.17在MGC-803和MKN45细胞株中E-cadherin和N-cadherin表达水平显著升高,Vimentin的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。【结论】1、通过测序及分层聚类分析筛选出在弥漫型胃癌中异常高表达的lncRNA RP11-357H14.17。LncRNA RP11-357H14.17在弥漫型胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常胃粘膜组织的表达量。2、体外下调胃癌细胞株中lncRNA RP11-357H14.17的表达显示,RP11-357H14.17在弥漫型胃癌中能够促进肿瘤细胞的增殖,影响胃癌细胞周期,抑制细胞凋亡,并促进细胞的侵袭和迁移。体内实验表明RP11-357H14.17能够促进裸鼠种植肿瘤的生长。3、LncRNA RP11-357H14.17可能通过影响EMT来达到促进侵袭和转移的作用。4、LncRNA RP11-357H14.17在弥漫型胃癌中发挥致癌作用,有望成为弥漫型胃癌诊断和预后的标记物,以及提供治疗的有效靶点。