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肠球菌属(Enterococcus)细菌为兼性厌氧的革兰氏阳性球菌，是人、犬、禽、猪、马等动物胃肠道正常菌群之一，也广泛分布于土壤、水和食物中。长期以来被认为致病力较低而未引起重视，但近年来，肠球菌属条件致病菌所致感染的发生率持续升高，尤其在原有严重基础疾病及机体免疫力降低时，极易侵入体内或易位，导致局部或全身重症感染，给临床治疗带来困难。
１材料与方法
１.1材料
１.1.1粪 样
选自黑龙江垦区某农场的40头健康荷斯坦泌乳牛，采集其新鲜粪便作为试验材料。
１.1.2培养基
血平板、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、普通营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、葡萄糖肉汤、营养肉汤、生化鉴定管等均购自广东环凯生物科技有限公司。
１.1.3试验动物
18～26 g健康的小白鼠。
１.2方法
１.2.1粪样的采集
肛门式采集。用无菌橡胶手套直接从试验牛的肛门采集新鲜粪样，分别装入无菌蓝盖试剂瓶中，立即送实验室4 ℃保存备用。
１.2.2细菌的分离鉴定
１.2.2.1细菌的分离纯化培养
将新鲜粪样接种于葡萄糖肉汤中，置37℃，18～24h，进行增菌培养。再将肉汤培养物接种到KF链球菌琼脂上，置37℃，培养24h。将可疑菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检。并接种于胰蛋白胨大豆琼脂、营养琼脂、血平板、麦康凯琼脂和葡萄糖肉汤、营养肉汤培养基中，置37℃培养18～24h，观察菌落生长状况。观察细菌生长状况以及菌落形态特征，并将其进一步纯化培养。将所得纯培养物置胰蛋白胨大豆琼脂斜面保存备用。
１.2.2.2触酶试验
从固体培养基上挑取1接种环待检菌,置于洁净玻片上，再滴加3%过氧化氢一大滴，立即观察结果。在30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。
１.2.2.3溶血试验
用平板法测定分离菌的溶血特性，即取分离菌接种于血平板上，于37℃培养24 h后观察菌落周围溶血现象。若菌落周围出现溶血环（完全溶血），或出现草绿色溶血环（不完全溶血）为阳性。若菌落周围无溶血现象为阴性。
１.2.2.4细菌的生化鉴定试验
将所得菌落葡萄糖肉汤培养物分别接种于各种微量生化鉴定管 ,经37℃培养24 h～48 h后观察结果。
１.2.3动物试验
从35株分离菌中随机抽取20株，取其37℃、18～24h葡萄糖肉汤培养物，以0.5ml/只的剂量，分别进行小白鼠腹腔注射，每种细菌做2个重复及无菌葡萄糖肉汤作对照。接种后的小白鼠在同样条件下隔离饲养，观察24h内的发病死亡情况，对死亡或发病明显者立即进行剖检，取发病小白鼠的心、肝组织涂片、镜检，若与注入细菌相同，则判定此菌为病原菌。对未见发病的小白鼠继续观察1周。
１.2.4药敏试验
取各中草药50g,加5～10倍蒸馏水浸泡30 min后煎煮,武火加热至沸后文火维持30 min，用4层纱布过滤，滤出煎液，滤渣按上述方法再煎煮1次，合并2次滤液，浓缩至生药含量1g/ml，然后1000r/min离心10 min，取上清液，100℃水浴灭菌10 min后，置4℃冰箱中保存备用。
采用牛津杯法。分别加入100 μL药液于已制备好的带有菌层的平皿中的牛津杯内，盖好，37℃培养24 h，测量抑菌圈直径，当直径在10mm～15mm之间为敏感，大于15mm为高敏感。
２结果与分析
２.1细菌形态
经革兰氏染色后镜检,可见革兰氏阳性球菌,圆形或卵圆形,成双或链状排列,无鞭毛、无芽孢、无荚膜。
２.2细菌分离
从40份样品中，分离到35株革兰氏染色阳性、球形、能够排列成链状、过氧化氢酶试验阴性的细菌。分菌率为87.5%。
２.3酶酶试验
取可疑菌落置于洁净玻片上，滴加一滴3%过氧化氢，见无气泡冒出,故分离菌株触酶试验为阴性。
２.4溶血试验
取分离菌接种于血平板上，于37℃培养24 h后观察到近2/3菌株其菌落周围无溶血现象，而近1/3菌株其菌落周围出现1～2mm宽的草绿色溶血环。说明多数菌落溶血试验呈阴性，少数呈阳性。
２.5动物试验
小白鼠接种粪肠球菌18～24h葡萄糖肉汤培养液后观察2d，发现接种细菌的小白鼠在48 h内有死亡发生，死亡率为13/40。剖检死亡小白鼠可见肝脏充血，出血，肠管鼓气。未死亡的小白鼠均表现出不同程度发病，如精神萎靡，采食减少，不愿走动等。将未死亡小鼠继续观察至1周，扑杀后剖检其内脏器官未见明显的病变。而对照组的小白鼠均很正常。从以上发病或死亡小白鼠的脾脏、肝脏和心脏等部位均能分离到原接种细菌。
３讨论
粪肠球菌的分离与鉴定
粪肠球菌是人类和动物肠道正常菌群的成员，通常在引起腹腔和盆腔感染所分离的混合菌中发现，以往认为粪肠球菌是对人类无害的共栖菌，但近年研究已证实了肠球菌的致病力。在需氧革兰氏阳性球菌中，它是仅次于葡萄球菌的重要医院内感染致病菌。粪肠球菌不仅可引起尿路感染、皮肤软组织感染，还可引起危及生命的腹腔感染、败血症、心內膜炎和脑膜炎等。本研究从呼和浩特市某奶牛场40头健康荷斯坦泌乳牛的新鲜粪样中共分离出35株疑似粪肠球菌，经细菌培养特征、形态染色特性、触酶试验、溶血试验以及生化鉴定等试验结果表明，所分离出的菌株均属粪肠球菌，分离率为87.5%。同时从动物致病性试验结果可知，所分离到的粪肠球菌均能引起小白鼠不同程度发病，死亡率为32.5%。说明粪肠球菌既是人和动物肠道中的正常菌群，也是畜禽粪便污染所带来的重要病原菌。其致病力不是很强，但常可引起抵抗力低下宿主的多种机会感染。
牛粪作为肠球菌的主要定殖场所，其有效处理不仅降低致病性肠球菌以及其它病原微生物的传播，还可减少环境污染、降低疾病蔓延，对公共卫生具有重大意义。
（作者单位：156511黑龙江省抚远县前哨农场畜牧科、抚远县前哨农场兽医站）
１材料与方法
１.1材料
１.1.1粪 样
选自黑龙江垦区某农场的40头健康荷斯坦泌乳牛，采集其新鲜粪便作为试验材料。
１.1.2培养基
血平板、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、普通营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、葡萄糖肉汤、营养肉汤、生化鉴定管等均购自广东环凯生物科技有限公司。
１.1.3试验动物
18～26 g健康的小白鼠。
１.2方法
１.2.1粪样的采集
肛门式采集。用无菌橡胶手套直接从试验牛的肛门采集新鲜粪样，分别装入无菌蓝盖试剂瓶中，立即送实验室4 ℃保存备用。
１.2.2细菌的分离鉴定
１.2.2.1细菌的分离纯化培养
将新鲜粪样接种于葡萄糖肉汤中，置37℃，18～24h，进行增菌培养。再将肉汤培养物接种到KF链球菌琼脂上，置37℃，培养24h。将可疑菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检。并接种于胰蛋白胨大豆琼脂、营养琼脂、血平板、麦康凯琼脂和葡萄糖肉汤、营养肉汤培养基中，置37℃培养18～24h，观察菌落生长状况。观察细菌生长状况以及菌落形态特征，并将其进一步纯化培养。将所得纯培养物置胰蛋白胨大豆琼脂斜面保存备用。
１.2.2.2触酶试验
从固体培养基上挑取1接种环待检菌,置于洁净玻片上，再滴加3%过氧化氢一大滴，立即观察结果。在30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。
１.2.2.3溶血试验
用平板法测定分离菌的溶血特性，即取分离菌接种于血平板上，于37℃培养24 h后观察菌落周围溶血现象。若菌落周围出现溶血环（完全溶血），或出现草绿色溶血环（不完全溶血）为阳性。若菌落周围无溶血现象为阴性。
１.2.2.4细菌的生化鉴定试验
将所得菌落葡萄糖肉汤培养物分别接种于各种微量生化鉴定管 ,经37℃培养24 h～48 h后观察结果。
１.2.3动物试验
从35株分离菌中随机抽取20株，取其37℃、18～24h葡萄糖肉汤培养物，以0.5ml/只的剂量，分别进行小白鼠腹腔注射，每种细菌做2个重复及无菌葡萄糖肉汤作对照。接种后的小白鼠在同样条件下隔离饲养，观察24h内的发病死亡情况，对死亡或发病明显者立即进行剖检，取发病小白鼠的心、肝组织涂片、镜检，若与注入细菌相同，则判定此菌为病原菌。对未见发病的小白鼠继续观察1周。
１.2.4药敏试验
取各中草药50g,加5～10倍蒸馏水浸泡30 min后煎煮,武火加热至沸后文火维持30 min，用4层纱布过滤，滤出煎液，滤渣按上述方法再煎煮1次，合并2次滤液，浓缩至生药含量1g/ml，然后1000r/min离心10 min，取上清液，100℃水浴灭菌10 min后，置4℃冰箱中保存备用。
采用牛津杯法。分别加入100 μL药液于已制备好的带有菌层的平皿中的牛津杯内，盖好，37℃培养24 h，测量抑菌圈直径，当直径在10mm～15mm之间为敏感，大于15mm为高敏感。
２结果与分析
２.1细菌形态
经革兰氏染色后镜检,可见革兰氏阳性球菌,圆形或卵圆形,成双或链状排列,无鞭毛、无芽孢、无荚膜。
２.2细菌分离
从40份样品中，分离到35株革兰氏染色阳性、球形、能够排列成链状、过氧化氢酶试验阴性的细菌。分菌率为87.5%。
２.3酶酶试验
取可疑菌落置于洁净玻片上，滴加一滴3%过氧化氢，见无气泡冒出,故分离菌株触酶试验为阴性。
２.4溶血试验
取分离菌接种于血平板上，于37℃培养24 h后观察到近2/3菌株其菌落周围无溶血现象，而近1/3菌株其菌落周围出现1～2mm宽的草绿色溶血环。说明多数菌落溶血试验呈阴性，少数呈阳性。
２.5动物试验
小白鼠接种粪肠球菌18～24h葡萄糖肉汤培养液后观察2d，发现接种细菌的小白鼠在48 h内有死亡发生，死亡率为13/40。剖检死亡小白鼠可见肝脏充血，出血，肠管鼓气。未死亡的小白鼠均表现出不同程度发病，如精神萎靡，采食减少，不愿走动等。将未死亡小鼠继续观察至1周，扑杀后剖检其内脏器官未见明显的病变。而对照组的小白鼠均很正常。从以上发病或死亡小白鼠的脾脏、肝脏和心脏等部位均能分离到原接种细菌。
３讨论
粪肠球菌的分离与鉴定
粪肠球菌是人类和动物肠道正常菌群的成员，通常在引起腹腔和盆腔感染所分离的混合菌中发现，以往认为粪肠球菌是对人类无害的共栖菌，但近年研究已证实了肠球菌的致病力。在需氧革兰氏阳性球菌中，它是仅次于葡萄球菌的重要医院内感染致病菌。粪肠球菌不仅可引起尿路感染、皮肤软组织感染，还可引起危及生命的腹腔感染、败血症、心內膜炎和脑膜炎等。本研究从呼和浩特市某奶牛场40头健康荷斯坦泌乳牛的新鲜粪样中共分离出35株疑似粪肠球菌，经细菌培养特征、形态染色特性、触酶试验、溶血试验以及生化鉴定等试验结果表明，所分离出的菌株均属粪肠球菌，分离率为87.5%。同时从动物致病性试验结果可知，所分离到的粪肠球菌均能引起小白鼠不同程度发病，死亡率为32.5%。说明粪肠球菌既是人和动物肠道中的正常菌群，也是畜禽粪便污染所带来的重要病原菌。其致病力不是很强，但常可引起抵抗力低下宿主的多种机会感染。
牛粪作为肠球菌的主要定殖场所，其有效处理不仅降低致病性肠球菌以及其它病原微生物的传播，还可减少环境污染、降低疾病蔓延，对公共卫生具有重大意义。
（作者单位：156511黑龙江省抚远县前哨农场畜牧科、抚远县前哨农场兽医站）