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摘要：从湖南省汨罗市血吸虫防治基地土壤中分离得到1株灭螺活性较强的微生物菌株B59，以B59菌株的总DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增并测其核酸序列，得到1条约1 500 bp的片段。通过Blast软件在GenBank中进行同源性检索，将其与同源性较高的菌株的ITS序列进行ClustalX序列差异和同源性分析，分别使用MEGA 6.0软件中的邻接法、Phylip软件中的最大简约法及最大似然法构建系统发育树。结果显示，3种方法构建的系统发育树基本一致，B59菌株与Bacillus cereus的亲缘关系最近，聚为一支，相似度达100%。
关键词：钉螺；微生物；16S rDNA；系统发育树
中图分类号： R383.2 4；S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0016-03
血吸虫病是一种严重危害人类公共健康和社会经济发展的人兽共患寄生虫病，主要流行于非洲、东南亚等国家，每年有690万～750万人被感染[1]，虽然目前在我国得到了很好的控制，但是日本血吸虫病仍然被政府认定为4种高度传染病之一[2-3]，甚至在许多地区，服用大剂量吡喹酮后的人群再感染率仍大于20%[4]。湖北钉螺是日本血吸虫唯一的中间宿主，是造成日本血吸虫病流行的重要根源。据统计，截至2013年底血吸虫病流行县（市、区）比2012年新增2个，达到454个，总人口为2.49亿人，血吸虫病的流行村有30 352个[5]。因此，控制钉螺以打破寄生虫的生活史是目前全国控制血吸虫病的比较重要和有效的措施[6]。但是由于复杂的经济、社会、环境和生物等因素的影响，目前仍不确定控制钉螺最经济有效的方法。目前控制钉螺的方法主要有3种，即物理灭螺、化学药物灭螺和生物生态灭螺。微生物灭螺由于其稳定、高效，对非靶生物无毒性，具有更多的生物多样性、丰富的代谢途径或产物，同时生长周期短，可诱导产物产生等优势[7-9]，是目前较有前景的灭螺方法，因此寻找理想的灭螺微生物的工作一直在进行。B59菌株是笔者实验室从土壤中筛选到的1株灭螺活性较高的微生物[10]，准确地对其进行分类鉴定是后续工作的必要前提。細菌16S rDNA序列分析技术具有高效、方便、准确、快捷等特点，广泛应用于各种细菌的遗传特征和分子差异的研究。本研究对B59菌株的16S rDNA PCR扩增产物的序列进行测定，对所测序列进行同源性分析和系统发育树构建，以鉴定其分类地位，为进一步应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 B59菌株是从湖南省汨罗市血吸虫病防治研究试验基地的螺池土壤中分离纯化得到，由笔者实验室保存。
1.1.2 主要试剂和仪器 2×Taq Master Mix、DNA marker（DL2000），均购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成；My CyclerTM thermal cycler PCR仪，购自美国Bio-Rad公司；UVP-GDS8000凝胶成像分析系统，购自美国UVP公司；PowerPac Univarsal电泳仪，购自美国Bio-Rad公司；H1850R台式高速低温离心机，购自湖南湘仪动力测试仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 菌体培养 供试菌株在LB斜面培养基上活化培养后接种于LB液体培养基中，28 ℃、160 r/min振荡培养过夜，4 ℃ 保存备用。
1.2.2 细菌基因组DNA的提取 参照DNA提取试剂盒的说明书提取B59菌株基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。
1.2.3 16S rDNA的PCR扩增 采用细菌16S rDNA的通用引物，F：5′-AGAGTTTGATCCGGCTCAG-3′，R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系（25 μL）为：2×PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物（50 μmol/L）各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳进行验证后，扩增产物送北京华大基因科技有限公司进行序列测定。
1.2.4 数据分析 运用ContigExpress软件进行序列拼接以得到B59菌株的16S rDNA基因全序列，将其提交至GenBank核酸序列数据库（ http：//www.ncbi. nlm.nih.gov），在NCBI上进行Blast在线检索，搜索其相近序列，采用ClustalX进行多序列比对后，通过MEGA 6.0中的邻接法（NJ）、Phylip 3695中的最大简约法（MP）及最大似然法（ML）[11]构建系统发育树，并进行Bootstrap稳定性检验（1 000次）。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA的PCR扩增结果
以“1.2.2”节中的方法提取得到B59菌株的基因组DNA，电泳检测到其条带清晰，无拖尾现象，可直接用于PCR。菌株B59的16S rDNA扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到1条约1 500 bp的特征性条带（图1），与预期的大小一致，扩增特异性较高。
2.2 目的基因16S rDNA序列分析
运用ContigExpress软件对序列进行杂峰修正和正反序列拼接，结果表明B59菌株的16S rDNA长度为1 490 bp（图2）。
2.3 系统发育树构建
将B59菌株的16S rDNA序列在GenBank中进行在线Blast比对，以大肠埃希菌（Escherichia coli）为外群，选取同源性较近的9个序列与B59菌株建立比对模型，分别运用NJ、MP、ML法一起构建基于16S rDNA序列的系统发育树，利用Bootstrap生成1 000个自展数据集对进化树进行可靠性分析（图3、图4、图5）。 由图3、图4可知，NJ法和MP法构建的分子系统树得到基本一致的拓扑结构，在系统树上，E.coli作为外群单独分为一支，其余分为2支，但两序列经Bootstrap验证都有很高的支持率，说明其系统关系的可信度较高。NJ法构建的系统发育树中，B59菌株（KP146144） 与蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）聚为同一分支，亲缘关系最近，序列的相似性高达100%；MP法构建的系统发育树中，B59菌株与Bacillus cereus位于枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）和土壤芽胞杆菌（Solibacillus silvestris）分支上，其序列相似性达100%；而图5中，由ML法构建的系统发育树中，B59菌株与Bacillus cereus也聚为同一分支，序列相似性达100%，但其位于大肠埃希菌分支上，序列的相似性同为100%。
3 讨论
16S rDNA是原核生物在漫长的进化过程中十分保守的序列，在现代微生物的分类鉴定中扮演着重要的角色[12]，具有分子量大小适中、信息量大、易于分析、突變率小等优点，是细菌分类学研究中最常用的分子钟，素有细菌化石之称[13]，是种属鉴定的分子基础，得到多个国际权威机构FDA、NASA、TIGR等的认可[14]。基于16S rDNA序列可对物种之间的同源性进行分析，如果同源性小于98%，认为属于不同种；同源性小于93%～95%，认为属于不同属[15]。
基于分子水平的系统发育推断方法可分为2类，即基于字符序列的方法和基于距离的方法。基于字符序列的方法利用统计技术定义一个最优化标准，对树的优劣进行评价，包括最大简约法、最大似然法。最大简约法希望用最小的改变来解释所要研究的分类群体之间的差异，但这种方法在物种数量较大时，变得不实用，且没有考虑树中分支的长度，这样无法反映出不同物种间进化距离的长短[16]；最大似然法具有良好的统计性质，能够更加有效地刻画不同物种间的进化距离，但其计算量非常大，也是一个NP-难题[17]，在物种数量较大时是不适用的，且这种方法对模型的依赖性较高，导致其在很多情况下应用存在困难；基于距离的NJ法通常无法找到精确的最小进化树，只能找到近似的，但其计算速度非常快，且准确率较高，因此常被用于系统发育分析[18]。
这3类建树方法由于各自的局限性均有可能导致系统产生误差，为了避免误差的影响，本研究同时采用3种方法构建系统进化树以综合分析系统发育关系。结果表明，3种方法构建的系统发育树中，虽然由ML法构建的发育树中，Lysinibacillus sphaericus单独作为外群与其他2种方法不同，但是B59菌株与Bacillus cereus都聚为一支，且置信度较高，均为100%，说明本研究构建的系统发育树是可信的，与郭青云等的研究结果[19]一致。因此，将B59菌株归为B. cereus，B. cereus能产生多种化合物如溶血素、脂肽类抗菌物质、多烯类物质及氨基糖苷等物质，这些物质对多数细菌、病毒、真菌及虫体有毒性作用，这可能是钉螺致死的主要原因[ 20-22]。然而，目前有极少研究报道B. cereus具有灭螺活性，其具体的灭螺活性物质的成分、结构、纯化等有待进一步研究。
4 结论
采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增得到B59菌株的16S rDNA序列，运用ContigExpress软件进行序列拼接，该序列长度为1 490 bp，运用NJ、MP及ML法构建系统发育树，结果表明，B59菌株与Bacillus cereus的亲缘关系最近，聚为一支，相似度达100%。
参考文献：
[1] Cui G Y，Wang S P，Cheng H B，et al. Screening of microorganisms against Oncomelania hupensis and assessing the molluscicidal efficacy[J]. Microbiology China，2015，42（6）：1060-1066.
[2]Dai J R，Li Y Z，Wang F，et al. Sensitivity of Oncomelania hupensis to niclosamidea nation-wide survey in China[J]. International Journal of Environmental Research，2014，11（3）：3086-3096.
[3]Manus D P，Gray D J，Li Y S，et al. Schistosomiasis in the People’s Republic of China：the era of the three gorges dam[J]. Clinical Microbiology Review，2010，23（2）：442-466.
[4]McManus D P，Gray D J，Ross A G，et al. Schistosomiasis research in the dongting lake region and its impact on local and national treatment and control in China[J]. PLoS Neglected Tropical Diseases，2011，5（8）：e1053.
[5]李石柱，郑 浩，高 婧，等. 2012年全国血吸虫病疫情通报[J]. 中国血吸虫病防治杂志，2013，25（6）：557-563.
[6]Zhou X N，Bergquist R，Leonardo L，et al. Schistosomiasis japonica：control and research need[J]. Advance in Parasitology，2010，72：145-178. [7]Yang F，Long E，Wen J H，et al. Linalool，derived from Cinnamomum camphora （L.） Presl leaf extracts，possesses molluscicidal activity against Oncomelania hupensis and inhibits infection of Schistosoma japonicum[J]. Parasites
关键词：钉螺；微生物；16S rDNA；系统发育树
中图分类号： R383.2 4；S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0016-03
血吸虫病是一种严重危害人类公共健康和社会经济发展的人兽共患寄生虫病，主要流行于非洲、东南亚等国家，每年有690万～750万人被感染[1]，虽然目前在我国得到了很好的控制，但是日本血吸虫病仍然被政府认定为4种高度传染病之一[2-3]，甚至在许多地区，服用大剂量吡喹酮后的人群再感染率仍大于20%[4]。湖北钉螺是日本血吸虫唯一的中间宿主，是造成日本血吸虫病流行的重要根源。据统计，截至2013年底血吸虫病流行县（市、区）比2012年新增2个，达到454个，总人口为2.49亿人，血吸虫病的流行村有30 352个[5]。因此，控制钉螺以打破寄生虫的生活史是目前全国控制血吸虫病的比较重要和有效的措施[6]。但是由于复杂的经济、社会、环境和生物等因素的影响，目前仍不确定控制钉螺最经济有效的方法。目前控制钉螺的方法主要有3种，即物理灭螺、化学药物灭螺和生物生态灭螺。微生物灭螺由于其稳定、高效，对非靶生物无毒性，具有更多的生物多样性、丰富的代谢途径或产物，同时生长周期短，可诱导产物产生等优势[7-9]，是目前较有前景的灭螺方法，因此寻找理想的灭螺微生物的工作一直在进行。B59菌株是笔者实验室从土壤中筛选到的1株灭螺活性较高的微生物[10]，准确地对其进行分类鉴定是后续工作的必要前提。細菌16S rDNA序列分析技术具有高效、方便、准确、快捷等特点，广泛应用于各种细菌的遗传特征和分子差异的研究。本研究对B59菌株的16S rDNA PCR扩增产物的序列进行测定，对所测序列进行同源性分析和系统发育树构建，以鉴定其分类地位，为进一步应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 B59菌株是从湖南省汨罗市血吸虫病防治研究试验基地的螺池土壤中分离纯化得到，由笔者实验室保存。
1.1.2 主要试剂和仪器 2×Taq Master Mix、DNA marker（DL2000），均购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成；My CyclerTM thermal cycler PCR仪，购自美国Bio-Rad公司；UVP-GDS8000凝胶成像分析系统，购自美国UVP公司；PowerPac Univarsal电泳仪，购自美国Bio-Rad公司；H1850R台式高速低温离心机，购自湖南湘仪动力测试仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 菌体培养 供试菌株在LB斜面培养基上活化培养后接种于LB液体培养基中，28 ℃、160 r/min振荡培养过夜，4 ℃ 保存备用。
1.2.2 细菌基因组DNA的提取 参照DNA提取试剂盒的说明书提取B59菌株基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。
1.2.3 16S rDNA的PCR扩增 采用细菌16S rDNA的通用引物，F：5′-AGAGTTTGATCCGGCTCAG-3′，R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系（25 μL）为：2×PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物（50 μmol/L）各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳进行验证后，扩增产物送北京华大基因科技有限公司进行序列测定。
1.2.4 数据分析 运用ContigExpress软件进行序列拼接以得到B59菌株的16S rDNA基因全序列，将其提交至GenBank核酸序列数据库（ http：//www.ncbi. nlm.nih.gov），在NCBI上进行Blast在线检索，搜索其相近序列，采用ClustalX进行多序列比对后，通过MEGA 6.0中的邻接法（NJ）、Phylip 3695中的最大简约法（MP）及最大似然法（ML）[11]构建系统发育树，并进行Bootstrap稳定性检验（1 000次）。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA的PCR扩增结果
以“1.2.2”节中的方法提取得到B59菌株的基因组DNA，电泳检测到其条带清晰，无拖尾现象，可直接用于PCR。菌株B59的16S rDNA扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到1条约1 500 bp的特征性条带（图1），与预期的大小一致，扩增特异性较高。
2.2 目的基因16S rDNA序列分析
运用ContigExpress软件对序列进行杂峰修正和正反序列拼接，结果表明B59菌株的16S rDNA长度为1 490 bp（图2）。
2.3 系统发育树构建
将B59菌株的16S rDNA序列在GenBank中进行在线Blast比对，以大肠埃希菌（Escherichia coli）为外群，选取同源性较近的9个序列与B59菌株建立比对模型，分别运用NJ、MP、ML法一起构建基于16S rDNA序列的系统发育树，利用Bootstrap生成1 000个自展数据集对进化树进行可靠性分析（图3、图4、图5）。 由图3、图4可知，NJ法和MP法构建的分子系统树得到基本一致的拓扑结构，在系统树上，E.coli作为外群单独分为一支，其余分为2支，但两序列经Bootstrap验证都有很高的支持率，说明其系统关系的可信度较高。NJ法构建的系统发育树中，B59菌株（KP146144） 与蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）聚为同一分支，亲缘关系最近，序列的相似性高达100%；MP法构建的系统发育树中，B59菌株与Bacillus cereus位于枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）和土壤芽胞杆菌（Solibacillus silvestris）分支上，其序列相似性达100%；而图5中，由ML法构建的系统发育树中，B59菌株与Bacillus cereus也聚为同一分支，序列相似性达100%，但其位于大肠埃希菌分支上，序列的相似性同为100%。
3 讨论
16S rDNA是原核生物在漫长的进化过程中十分保守的序列，在现代微生物的分类鉴定中扮演着重要的角色[12]，具有分子量大小适中、信息量大、易于分析、突變率小等优点，是细菌分类学研究中最常用的分子钟，素有细菌化石之称[13]，是种属鉴定的分子基础，得到多个国际权威机构FDA、NASA、TIGR等的认可[14]。基于16S rDNA序列可对物种之间的同源性进行分析，如果同源性小于98%，认为属于不同种；同源性小于93%～95%，认为属于不同属[15]。
基于分子水平的系统发育推断方法可分为2类，即基于字符序列的方法和基于距离的方法。基于字符序列的方法利用统计技术定义一个最优化标准，对树的优劣进行评价，包括最大简约法、最大似然法。最大简约法希望用最小的改变来解释所要研究的分类群体之间的差异，但这种方法在物种数量较大时，变得不实用，且没有考虑树中分支的长度，这样无法反映出不同物种间进化距离的长短[16]；最大似然法具有良好的统计性质，能够更加有效地刻画不同物种间的进化距离，但其计算量非常大，也是一个NP-难题[17]，在物种数量较大时是不适用的，且这种方法对模型的依赖性较高，导致其在很多情况下应用存在困难；基于距离的NJ法通常无法找到精确的最小进化树，只能找到近似的，但其计算速度非常快，且准确率较高，因此常被用于系统发育分析[18]。
这3类建树方法由于各自的局限性均有可能导致系统产生误差，为了避免误差的影响，本研究同时采用3种方法构建系统进化树以综合分析系统发育关系。结果表明，3种方法构建的系统发育树中，虽然由ML法构建的发育树中，Lysinibacillus sphaericus单独作为外群与其他2种方法不同，但是B59菌株与Bacillus cereus都聚为一支，且置信度较高，均为100%，说明本研究构建的系统发育树是可信的，与郭青云等的研究结果[19]一致。因此，将B59菌株归为B. cereus，B. cereus能产生多种化合物如溶血素、脂肽类抗菌物质、多烯类物质及氨基糖苷等物质，这些物质对多数细菌、病毒、真菌及虫体有毒性作用，这可能是钉螺致死的主要原因[ 20-22]。然而，目前有极少研究报道B. cereus具有灭螺活性，其具体的灭螺活性物质的成分、结构、纯化等有待进一步研究。
4 结论
采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增得到B59菌株的16S rDNA序列，运用ContigExpress软件进行序列拼接，该序列长度为1 490 bp，运用NJ、MP及ML法构建系统发育树，结果表明，B59菌株与Bacillus cereus的亲缘关系最近，聚为一支，相似度达100%。
参考文献：
[1] Cui G Y，Wang S P，Cheng H B，et al. Screening of microorganisms against Oncomelania hupensis and assessing the molluscicidal efficacy[J]. Microbiology China，2015，42（6）：1060-1066.
[2]Dai J R，Li Y Z，Wang F，et al. Sensitivity of Oncomelania hupensis to niclosamidea nation-wide survey in China[J]. International Journal of Environmental Research，2014，11（3）：3086-3096.
[3]Manus D P，Gray D J，Li Y S，et al. Schistosomiasis in the People’s Republic of China：the era of the three gorges dam[J]. Clinical Microbiology Review，2010，23（2）：442-466.
[4]McManus D P，Gray D J，Ross A G，et al. Schistosomiasis research in the dongting lake region and its impact on local and national treatment and control in China[J]. PLoS Neglected Tropical Diseases，2011，5（8）：e1053.
[5]李石柱，郑 浩，高 婧，等. 2012年全国血吸虫病疫情通报[J]. 中国血吸虫病防治杂志，2013，25（6）：557-563.
[6]Zhou X N，Bergquist R，Leonardo L，et al. Schistosomiasis japonica：control and research need[J]. Advance in Parasitology，2010，72：145-178. [7]Yang F，Long E，Wen J H，et al. Linalool，derived from Cinnamomum camphora （L.） Presl leaf extracts，possesses molluscicidal activity against Oncomelania hupensis and inhibits infection of Schistosoma japonicum[J]. Parasites