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本文介绍了益智组织培养的研究现状，包括益智组织培养的外植体筛选、诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗、移栽等，探讨了益智组织培养推广应用的影响因素，并对益智组织培养的发展方向进行了展望。
益智Alpinia oxyphylla Miq.，别名益智仁、益智子，属姜科Zingiberaceae山姜属Alpinia多年生草本植物，是中国四大南药（槟榔、益智仁、砂仁、巴戟天）之一。益智果实益脾胃、理元气、补肾虚滑沥，药用价值极高。益智生长于阴湿林下，广泛分布于海南、广东、广西、福建和云南等地[1]。近年来，林下经济因投资少、产值高、见效快、省劳力等优势成为一种农业新兴产业。益智因喜阴等生长习性成为广东、海南、福建等省份的主要林下经济作物。
传统的益智种子播种育苗技术难以满足种苗需求，而且长期传统育种容易造成益智品质退化、产量降低，甚至品种变异，抗病虫能力降低，导致某些优良品种趋于灭绝[2]。
与传统的繁殖技术相比，植物组织培养技术具有繁殖周期短、成本低及人为可控性高等优点，繁殖系数大，可保留品种优良性状，避免农药及重金属污染等，已成为应用最广泛的育苗技术[3]。
1益智外植体筛选及增殖培养
以益智的块状茎芽、子叶、叶节等不同外植体进行愈伤组织诱导培养，筛选出块状茎芽是良好外植體。
将无菌块茎茎芽接种到1.2MS+6-BA1.0+ NAA0.1的单芽诱导培养基培养。15 d左右块茎茎芽生长，顶端伸长，基部膨大，产生少量愈伤组织；在30 d时观察，块茎茎芽顶端伸长并形成完整单芽，部分侧芽萌发形成完整单芽，块茎茎芽基部明显膨大并伴生少量愈伤组织。朱文丽等[4]对益智块茎茎芽进行了愈伤组织诱导培养，在培养基MS+6-BA3.0+NAA0.1+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉胶的培养效果最佳，外植体明显膨大，愈伤组织质地紧密，培养30 d后，愈伤组织可增殖2～3倍。黄梅花等[5]以益智块茎茎芽、子叶、叶节等为试验材料，研究益智组培技术，结果表明块茎芽是良好外植体，见图1。
2外植体消毒
于晴天正午挖取益智未展叶块茎茎芽，去土去根，在块茎茎芽苞片与姜块交界处切断，保持益智湿润并带回实验室；将采集的外植体置于饱和漂白粉溶液中浸泡30 min，用无菌水洗净，转移至0.1%升汞溶液处理15 min，使用无菌水漂洗4次以上，将漂洗干净的外植体进行第二次切割，将块茎茎芽外层苞片剥离，切除接触升汞溶液的部分，从中轴纵切成两半，接种到空白MS培养基。
切下新抽出的块茎茎芽，用清水洗净芽上的杂物，用洗衣粉浸泡20 min后，用清水冲洗。在超净工作台上，按常规方法消毒灭菌，无菌水冲洗4～5次后，切取长约1 cm的牙尖，接种于诱导培养基上。将块茎用清水洗净后放入已经消毒的培养容器内，置于超净工作台上，再用75%乙醇表面消毒1 min，再用0.1%（w/v）氯化汞浸泡消毒10 min，最后用无菌水冲洗3遍，再用无菌滤纸吸干表面水分。
3丛生不定芽诱导培养
将生长状况良好的单芽接种取出，在无菌条件下切除单芽基部愈伤组织，转接至1.2MS+ 6-BA3.0+KT0.6+蔗糖45 g/L的丛生芽诱导培养基上。每30 d转接一代，单芽基部膨大，产生少量不定芽，将原接种单芽纵切为带一半原单芽及部分不定芽的组织块，转移至相同培养基，愈伤组织剔除；转接30 d后，组织块膨大，产生大量不定芽，形成密集的丛生芽。将愈伤组织转接于培养基MS+6-BA6.0+NAA0.1+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉胶上，效果最佳，分化的小芽数量多且均匀，形成芽丛。适宜的丛生芽分化培养基是MS+6-BA4 mg/L+5%蔗糖+0.6%卡拉胶+0.05%普罗丹叶面肥，见图2。
4丛生不定芽增殖培养
将获得的密集丛生芽，切割为带3～5不定芽的组织块，接种至丛生芽增殖培养基1.2MS+ 6-BA0.5+KT0.2+蔗糖45 g/L上。在培养过程中，原接种组织块体积迅速增加，不定芽形成1.5～2 cm且生长健壮的丛生芽，丛生芽高速增长的同时，基部形成较多的不定芽，实现迅速增殖，其后每30 d继代转接1次。将芽丛分切成小芽丛，在培养基MS+6-BA6.0+NAA0.1+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉胶上进行继代培养，30 d后每个不定芽基部分化出2～3个小芽。每30 d继代1次，2～3代后，不定芽增殖系数可达4～6，见图3。
5壮苗培养
将健壮丛生芽切割为带有3～5个健壮单芽的组织块，接种至壮苗培养基上，该培养基配方为1.2MS+KT0.1+NAA0.1+蔗糖60 g/L。接种后30 d，原接种单芽形成3.0～4.0 cm高度且生长健壮的单芽，基部不定芽生长为1.5～2.5 cm高度且生长健壮的单芽，见图4。
6生根培养
将获得的单芽切割分级，植株高度在3～4 cm的单芽接种生根培养基，植株高度小于3 cm的单芽重新接种至壮苗培养基上。生根培养基配方为1.2MS+NAA0.5 mg/L+IBA0.5+甲哌嗡1.0 mg/L，附加90 g/L蔗糖，活性炭0.05 g。生根苗接种后15 d，单芽基部出现5～8个可见的白色根原突起，后形成粗壮的白色不定根；接种后30 d，不定根萌发侧根，形成完整的根系。将丛生不定芽分切为单芽，接种于培养基1/2MS+NAA0.2+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉胶上，1周后抽出不定根，4周后苗高4 cm以上，生根率100%。待苗长至3～4 c m高度时移至生根培养基1/2MS+NAA1 mg/L+6%蔗糖+0.6%卡拉胶+0.25%活性炭+0.1%普罗丹叶面肥上，25 d后即可长成株高6～8 cm，有2～3蓬叶，2～3条根的小苗，生根率100%，根系旺盛，分支多而细长，苗体健壮，见图5。
7生根苗炼苗
将生根苗带瓶置于温室内进行炼苗，炼苗温度25～35℃，在晴天9：00～16：30炼苗棚棚顶遮阳，其余时间遮阳网全开透光，阴雨天全天透光。将瓶苗置于50%荫蔽度的大棚内，炼苗1周。培养30～50 d，根系发达，植株高为6～8 cm的益智瓶苗移到温室，在自然光下闭口炼苗3 d，再置于阴凉通风的大棚内进行开盖炼苗3 d，适时喷水，以提高瓶苗的适应能力，见图6。
8生根苗移栽
移栽完成后使用亮盾1 500倍液喷湿苗木及基质，不浇定根水。移栽后1周，使用喷雾器喷水保湿，在移栽后5 d，喷洒生根水1次，可选择国光根盼（萘乙酸？吲哚丁酸）1 000倍液，移栽后10 d，喷洒杀菌剂1次，可选择25%咪鲜胺乳油800～1 200倍，加入叶面肥。移栽后15 d，进行正常容器苗管理流程，禁止积水，同时避免因干旱导致卷叶甚至死苗。每月使用水溶性复合肥浇灌1次，浓度为0.2%～0.5%，如苗木生长过旺，可喷洒25%丙环唑乳油2 500倍液1次，在抑制过快生长同时可起到良好地防病作用。将小苗取出试管，用清水洗净附着在根系上的培养基，再用0.2%多菌灵浸泡20 min后，栽植在装满营养土（表土∶河沙∶椰糠=2∶2∶1）的营养杯中，浇透定根水后覆盖50%遮荫网。1周左右，小苗恢复生长，以后按照常规育苗方法管理。试管苗移栽成活率100%。将生根苗移出瓶外，用清水洗净根部附着的培养基，放入0.1%多菌灵溶液中浸泡消毒10 min，用清水洗净后移栽到预先消毒处理过的河沙中，河沙用营养杯分装，每杯栽种1株，浇水淋透，适当保湿遮荫。15 d喷施1次营养液，进行常规管理。30 d后组培瓶苗移栽成活率达到90%以上，移栽成活率提高10%。曾武等[6]对益智组培幼态苗进行了分株繁育，育苗时间为8～12月，选择取水方便、地势平坦、不易积水、背风的地方为育苗场，搭建遮光度为75%的简易荫棚；将幼态苗从原育苗穴盘中整丛苗拔出后，抖净根系的轻基质，剪掉约1/2叶片，保持植株高不超过30 cm，将每个侧芽用利刀分别从母株上先后切下来，形成单株的分株苗。每个芽基部都要带有完整的根系，收集起来放入保湿的毛巾包好，及时拿到育苗棚内栽入穴盘中。按照常规方法做好肥水管理、病虫害防治等，见图7。
9培养条件
益智组培苗的诱导、分化和增殖生长不仅需要适宜的培养基，还与温度、光照、等条件有关。在益智组织培养时，温度25℃，光照时间12 h/d，光照强度1 800 lx较好。
10展望
当前，中国依托药用植物资源、气候生态、政策扶持、中药市场、中药文化等优势，大力开发药用植物，产业规模逐年扩大，市场需求旺盛。“四大南药”之一的益智因其经济价值大、市场前景好、效益高等优点受到种植户的欢迎，中国益智种植产业正逐渐壮大。益智组织培养技术的广泛应用，增强了益智育苗的数量和质量，提供了更多优质的无性系种苗，提高了益智产量、品质和市场竞争力，经济效益明显，应用前景十分广阔。
但是，中国益智种质资源混杂，收集保存工作处于初步开展阶段，优良品种选育、鉴定评价指标、制定行业标准等工作还需要完善。若有些益智品种繁育效果不理想，需再次对以上技术进行革新。
参考文献
[1]黄国琦.益智丰产栽培技术[J].广东林业科技，2013，29（2）：4-77.
[2]蒙真铖，苏翠，杨曦，等.山药组织培养研究进展[J].热带农业科学，2017，37（7）：85-88，94.
[3]冯婷婷，郭九峰，宋天磊，等.药用植物组织培养研究综述[J].安徽农学通報，2019，25（24）：23-27.
[4]朱文丽，刘小涛，莫饶，等.益智的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2005（3）：335.
[5]黄梅花，张明俊，谢黎黎.益智组织培养技术研究[J].农业开发与装备，2019（10）：114-115.
[6]曾武，黎建伟，林锦容，等.益智组培幼态苗分株繁殖技术[J].热带林业，2019，47（1）：10-11.
基金项目：广东省林业科技创新项目（No.2016KJCX008、2019KJCX006）。
[广东茂名市林业科学研究所卜蜜源，林思诚（通讯作者），王祥，冼世庆，刘付月清]
益智Alpinia oxyphylla Miq.，别名益智仁、益智子，属姜科Zingiberaceae山姜属Alpinia多年生草本植物，是中国四大南药（槟榔、益智仁、砂仁、巴戟天）之一。益智果实益脾胃、理元气、补肾虚滑沥，药用价值极高。益智生长于阴湿林下，广泛分布于海南、广东、广西、福建和云南等地[1]。近年来，林下经济因投资少、产值高、见效快、省劳力等优势成为一种农业新兴产业。益智因喜阴等生长习性成为广东、海南、福建等省份的主要林下经济作物。
传统的益智种子播种育苗技术难以满足种苗需求，而且长期传统育种容易造成益智品质退化、产量降低，甚至品种变异，抗病虫能力降低，导致某些优良品种趋于灭绝[2]。
与传统的繁殖技术相比，植物组织培养技术具有繁殖周期短、成本低及人为可控性高等优点，繁殖系数大，可保留品种优良性状，避免农药及重金属污染等，已成为应用最广泛的育苗技术[3]。
1益智外植体筛选及增殖培养
以益智的块状茎芽、子叶、叶节等不同外植体进行愈伤组织诱导培养，筛选出块状茎芽是良好外植體。
将无菌块茎茎芽接种到1.2MS+6-BA1.0+ NAA0.1的单芽诱导培养基培养。15 d左右块茎茎芽生长，顶端伸长，基部膨大，产生少量愈伤组织；在30 d时观察，块茎茎芽顶端伸长并形成完整单芽，部分侧芽萌发形成完整单芽，块茎茎芽基部明显膨大并伴生少量愈伤组织。朱文丽等[4]对益智块茎茎芽进行了愈伤组织诱导培养，在培养基MS+6-BA3.0+NAA0.1+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉胶的培养效果最佳，外植体明显膨大，愈伤组织质地紧密，培养30 d后，愈伤组织可增殖2～3倍。黄梅花等[5]以益智块茎茎芽、子叶、叶节等为试验材料，研究益智组培技术，结果表明块茎芽是良好外植体，见图1。
2外植体消毒
于晴天正午挖取益智未展叶块茎茎芽，去土去根，在块茎茎芽苞片与姜块交界处切断，保持益智湿润并带回实验室；将采集的外植体置于饱和漂白粉溶液中浸泡30 min，用无菌水洗净，转移至0.1%升汞溶液处理15 min，使用无菌水漂洗4次以上，将漂洗干净的外植体进行第二次切割，将块茎茎芽外层苞片剥离，切除接触升汞溶液的部分，从中轴纵切成两半，接种到空白MS培养基。
切下新抽出的块茎茎芽，用清水洗净芽上的杂物，用洗衣粉浸泡20 min后，用清水冲洗。在超净工作台上，按常规方法消毒灭菌，无菌水冲洗4～5次后，切取长约1 cm的牙尖，接种于诱导培养基上。将块茎用清水洗净后放入已经消毒的培养容器内，置于超净工作台上，再用75%乙醇表面消毒1 min，再用0.1%（w/v）氯化汞浸泡消毒10 min，最后用无菌水冲洗3遍，再用无菌滤纸吸干表面水分。
3丛生不定芽诱导培养
将生长状况良好的单芽接种取出，在无菌条件下切除单芽基部愈伤组织，转接至1.2MS+ 6-BA3.0+KT0.6+蔗糖45 g/L的丛生芽诱导培养基上。每30 d转接一代，单芽基部膨大，产生少量不定芽，将原接种单芽纵切为带一半原单芽及部分不定芽的组织块，转移至相同培养基，愈伤组织剔除；转接30 d后，组织块膨大，产生大量不定芽，形成密集的丛生芽。将愈伤组织转接于培养基MS+6-BA6.0+NAA0.1+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉胶上，效果最佳，分化的小芽数量多且均匀，形成芽丛。适宜的丛生芽分化培养基是MS+6-BA4 mg/L+5%蔗糖+0.6%卡拉胶+0.05%普罗丹叶面肥，见图2。
4丛生不定芽增殖培养
将获得的密集丛生芽，切割为带3～5不定芽的组织块，接种至丛生芽增殖培养基1.2MS+ 6-BA0.5+KT0.2+蔗糖45 g/L上。在培养过程中，原接种组织块体积迅速增加，不定芽形成1.5～2 cm且生长健壮的丛生芽，丛生芽高速增长的同时，基部形成较多的不定芽，实现迅速增殖，其后每30 d继代转接1次。将芽丛分切成小芽丛，在培养基MS+6-BA6.0+NAA0.1+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉胶上进行继代培养，30 d后每个不定芽基部分化出2～3个小芽。每30 d继代1次，2～3代后，不定芽增殖系数可达4～6，见图3。
5壮苗培养
将健壮丛生芽切割为带有3～5个健壮单芽的组织块，接种至壮苗培养基上，该培养基配方为1.2MS+KT0.1+NAA0.1+蔗糖60 g/L。接种后30 d，原接种单芽形成3.0～4.0 cm高度且生长健壮的单芽，基部不定芽生长为1.5～2.5 cm高度且生长健壮的单芽，见图4。
6生根培养
将获得的单芽切割分级，植株高度在3～4 cm的单芽接种生根培养基，植株高度小于3 cm的单芽重新接种至壮苗培养基上。生根培养基配方为1.2MS+NAA0.5 mg/L+IBA0.5+甲哌嗡1.0 mg/L，附加90 g/L蔗糖，活性炭0.05 g。生根苗接种后15 d，单芽基部出现5～8个可见的白色根原突起，后形成粗壮的白色不定根；接种后30 d，不定根萌发侧根，形成完整的根系。将丛生不定芽分切为单芽，接种于培养基1/2MS+NAA0.2+30 g/L蔗糖+5.8 g/L卡拉胶上，1周后抽出不定根，4周后苗高4 cm以上，生根率100%。待苗长至3～4 c m高度时移至生根培养基1/2MS+NAA1 mg/L+6%蔗糖+0.6%卡拉胶+0.25%活性炭+0.1%普罗丹叶面肥上，25 d后即可长成株高6～8 cm，有2～3蓬叶，2～3条根的小苗，生根率100%，根系旺盛，分支多而细长，苗体健壮，见图5。
7生根苗炼苗
将生根苗带瓶置于温室内进行炼苗，炼苗温度25～35℃，在晴天9：00～16：30炼苗棚棚顶遮阳，其余时间遮阳网全开透光，阴雨天全天透光。将瓶苗置于50%荫蔽度的大棚内，炼苗1周。培养30～50 d，根系发达，植株高为6～8 cm的益智瓶苗移到温室，在自然光下闭口炼苗3 d，再置于阴凉通风的大棚内进行开盖炼苗3 d，适时喷水，以提高瓶苗的适应能力，见图6。
8生根苗移栽
移栽完成后使用亮盾1 500倍液喷湿苗木及基质，不浇定根水。移栽后1周，使用喷雾器喷水保湿，在移栽后5 d，喷洒生根水1次，可选择国光根盼（萘乙酸？吲哚丁酸）1 000倍液，移栽后10 d，喷洒杀菌剂1次，可选择25%咪鲜胺乳油800～1 200倍，加入叶面肥。移栽后15 d，进行正常容器苗管理流程，禁止积水，同时避免因干旱导致卷叶甚至死苗。每月使用水溶性复合肥浇灌1次，浓度为0.2%～0.5%，如苗木生长过旺，可喷洒25%丙环唑乳油2 500倍液1次，在抑制过快生长同时可起到良好地防病作用。将小苗取出试管，用清水洗净附着在根系上的培养基，再用0.2%多菌灵浸泡20 min后，栽植在装满营养土（表土∶河沙∶椰糠=2∶2∶1）的营养杯中，浇透定根水后覆盖50%遮荫网。1周左右，小苗恢复生长，以后按照常规育苗方法管理。试管苗移栽成活率100%。将生根苗移出瓶外，用清水洗净根部附着的培养基，放入0.1%多菌灵溶液中浸泡消毒10 min，用清水洗净后移栽到预先消毒处理过的河沙中，河沙用营养杯分装，每杯栽种1株，浇水淋透，适当保湿遮荫。15 d喷施1次营养液，进行常规管理。30 d后组培瓶苗移栽成活率达到90%以上，移栽成活率提高10%。曾武等[6]对益智组培幼态苗进行了分株繁育，育苗时间为8～12月，选择取水方便、地势平坦、不易积水、背风的地方为育苗场，搭建遮光度为75%的简易荫棚；将幼态苗从原育苗穴盘中整丛苗拔出后，抖净根系的轻基质，剪掉约1/2叶片，保持植株高不超过30 cm，将每个侧芽用利刀分别从母株上先后切下来，形成单株的分株苗。每个芽基部都要带有完整的根系，收集起来放入保湿的毛巾包好，及时拿到育苗棚内栽入穴盘中。按照常规方法做好肥水管理、病虫害防治等，见图7。
9培养条件
益智组培苗的诱导、分化和增殖生长不仅需要适宜的培养基，还与温度、光照、等条件有关。在益智组织培养时，温度25℃，光照时间12 h/d，光照强度1 800 lx较好。
10展望
当前，中国依托药用植物资源、气候生态、政策扶持、中药市场、中药文化等优势，大力开发药用植物，产业规模逐年扩大，市场需求旺盛。“四大南药”之一的益智因其经济价值大、市场前景好、效益高等优点受到种植户的欢迎，中国益智种植产业正逐渐壮大。益智组织培养技术的广泛应用，增强了益智育苗的数量和质量，提供了更多优质的无性系种苗，提高了益智产量、品质和市场竞争力，经济效益明显，应用前景十分广阔。
但是，中国益智种质资源混杂，收集保存工作处于初步开展阶段，优良品种选育、鉴定评价指标、制定行业标准等工作还需要完善。若有些益智品种繁育效果不理想，需再次对以上技术进行革新。
参考文献
[1]黄国琦.益智丰产栽培技术[J].广东林业科技，2013，29（2）：4-77.
[2]蒙真铖，苏翠，杨曦，等.山药组织培养研究进展[J].热带农业科学，2017，37（7）：85-88，94.
[3]冯婷婷，郭九峰，宋天磊，等.药用植物组织培养研究综述[J].安徽农学通報，2019，25（24）：23-27.
[4]朱文丽，刘小涛，莫饶，等.益智的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2005（3）：335.
[5]黄梅花，张明俊，谢黎黎.益智组织培养技术研究[J].农业开发与装备，2019（10）：114-115.
[6]曾武，黎建伟，林锦容，等.益智组培幼态苗分株繁殖技术[J].热带林业，2019，47（1）：10-11.
基金项目：广东省林业科技创新项目（No.2016KJCX008、2019KJCX006）。
[广东茂名市林业科学研究所卜蜜源，林思诚（通讯作者），王祥，冼世庆，刘付月清]