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摘要：为了解维生素B12对海水圆型臂尾轮虫（Brachionus rotundiformis）种群增长、繁殖和个体大小的影响，采用四种不同浓度的维生素B12（0、0.3、0.6、1.2 μg/mL）强化培养轮虫7 d。每天测定轮虫的种群密度和怀卵率，每隔一天测定轮虫背甲长和宽。试验结果显示：0.3 μg/mL维生素B12组轮虫的种群增长、怀卵率显著高于其他组（P<0.05）;0.3 μg/mL维生素B12组轮虫的背甲长和宽均显著小于其他三组（P>0.05），而其他三组差异不显著。试验结论：在本试验条件下，维生素B12对圆型臂尾轮虫种群增长、繁殖和个体大小影响的最适浓度为0.3 μg/mL。
关键词：圆型臂尾轮虫（Brachionus rotundiformis）;维生素B12;种群增长;怀卵率;个体大小
维生素B12又叫钴胺素，可促进甲基转移，具有活化氨基酸，促进核酸生物合成，促进蛋白质合成的重要作用。如鱼类缺乏维生素B12，可造成食欲不振、生长缓慢以及贫血等病症[1]。然而自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能合成维生素B12 [2]。
在水产动物苗种培育阶段，生物饵料是不可或缺的部分，直接影响到水产养殖业的效益和发展[3-5]。而轮虫，因其营养丰富，适应力强、繁殖迅速、易培养等特点，已然成为鱼类、甲壳动物培养初期的重要开口饵料，在海水养殖育苗阶段，目前尚无其他活饵可以替代[6]。不同发育阶段的幼苗对饵料营养需求有所不同，因此，近几年对于开口饵料的营养强化研究已成为一个新的热点，国内外专家对于轮虫的研究都逐渐深入[7-11]。近年来关于维生素B12对轮虫生长情况的影响有所研究[12-14]，但关于维生素B12对于圆型臂尾轮虫（Brachionus rotundiformis）的种群增长、繁殖和个体大小影响的研究至今没有报道。
本试验通过研究圆型臂尾轮虫在不同维生素B12浓度条件下对轮虫的种群增长、怀卵率，背甲长和宽的影响，来探究维生素B12对轮虫的最适浓度，进而在培养轮虫过程中，对轮虫进行营养强化，为苗种提供更优质的开口饵料，进一步促进水产养殖业的发展。
1材料与方法
1.1试验材料
海水圆型臂尾轮虫来自于东海水产研究所水产实验室;活性干酵母是由湖北安琪酵母股份有限公司所提供。维生素B12购买于北京奥博星生物技术责任有限公司，所有的实验仪器均来自东海水产研究所水产养殖室。
1.2试验材料的准备
1.2.1圆型臂尾轮虫的保种方法试验前，将轮虫置于10 L的广口瓶中进行培养（人工配制海水、盐度为20‰[15]），在培养的过程中，连续充气，自然光照，培养温度设为（25±1）℃，pH为7.3～7.8。以酵母溶液作为轮虫的饵料，每天投饵一次，饵料投喂量为8×106 cell/mL[16-17]。
1.2.2试验指标的测定方法每24 h从每个锥形瓶中随机取3 mL轮虫培养液，加碘液固定后计数每毫升培养液中轮虫数量、怀卵率。每隔一天从试验组中随机取2 mL轮虫培养液，用盐酸固定，测定每毫升培养液轮虫其背甲长和背甲宽。重复三次。取样在无菌操作台中进行。
怀卵率=卵个数/轮虫总数量×100%
1.3试验设计
试验分为对照组、维生素B12组，对照组为正常培养组，不添加维生素B12，维生素B12组添加不同浓度的B12（0.3、0.6、1.2 μg/mL）[18-19]。所有仪器在试验前均已灭菌，酵母投喂量为8×106 cell/mL，轮虫培养体积为1 L，培养过程中保持自然光照，连续充气，设定温度为（25±1）℃，pH为7.3～7.8。轮虫以250 ind/mL的接种密度接种到500 mL盐度为20‰的锥形瓶中，放置到生化培养箱中培养，温度设定为25 ℃。三重复。培养时不断充气。每日投喂两次酵母溶液。
1.4统计分析
应用单因子方差分析（LSD和Duncan）比较各试验组的背甲长宽的差异显著性，应用单因子方差分析（Tukey）比较各试验组生长数据的显著性，差异显著性水平（P）值设在0.05，所有统计分析均采用SPSS20.0统计软件。误差和置信区间用mean±SE表示[20]。
2结果
2.1不同维生素B12浓度对轮虫种群密度的影响
在培养前1～2 d，各组轮虫种群增长较缓慢，第3天开始增长得比较快，轮虫种群量在第5天达到峰值，随后下降。而维生素B12添加浓度为0.3 μg/L组的轮虫在第3天大幅度增加，第5天达到峰值后下降，最后轮虫数量高于其他各组。见图1。该试验结果表明：在培养早期（1～2 d）维生素B12对轮虫的种群增长无显著（P>0.05）影响;在培养的中期（3～5 d）维生素B12浓度为0.3 μg/mL组的轮虫的种群增长显著（P<0.05）高于其他组。
2.2不同维生素B12浓度对轮虫怀卵率的影响
轮虫怀卵量在第2天开始就增长得比较快，在第3天达到峰值，随后下降。而维生素B12添加浓度为0.3 μg/mL组的轮虫在第2天大幅度增加，第3天达到峰值后下降，最后轮虫怀卵量趋于第1天，见图2。该试验结果表明：在培养后期（6～7 d）维生素B12对轮虫的怀卵量无显著（P>0.05）影响;在培养的中期（2～5 d）维生素B12对轮虫怀卵量影响显著（P>0.05），维生素B12浓度为0.3 μg/mL组的轮虫的怀卵率显著（P<0.05）高于其他组。
2.3不同维生素B12浓度对圆型臂尾轮虫背甲长宽的影响
0.3 μg/mL维生素B12组轮虫的背甲长和宽显著小于其他组（P>0.05），而其他三组差异不显著。见图3、图4。
3讨论
维生素最早在水产上的应用是解决育苗过程中轮虫培养的问题，开始使用酵母培养轮虫时，经常会因为缺乏不饱和脂肪酸而导致鱼苗体质较弱，此后人们逐渐开始通过添加维生素来改变这种营养缺陷[21-23]。维生素在水产育苗方面占据着不可忽略的地位。维生素E对鱼类的生长繁殖起着非常重要的作用，它可以通过一些化学反应促进鱼类生长和提高饲料效率[24]，在鱼类养成期长期缺乏维生素E会导致血糖不稳定，并且影响性腺发育成熟[25]。维生素C具有非常强的抗氧化能力，它能够促进胚胎发育，提高精液和鱼卵的质量[26-27]。维生素A在保障机体正常免疫方面占据着非常重要的作用[28-29]，并且维生素A可用于改善贫血，提高血红蛋白水平。在培养轮虫的水溶液中加入适量的L-肉碱可以促进细菌的繁殖，细菌可以作为轮虫的饵料，从而促进轮虫的生长繁殖[30]。此细菌可以分泌维生素B12，所以本试验以海水圆型臂尾轮虫（Brachionusrotundiformis）作为研究对象，设置四种不同浓度的维生素B12（0.0、0.3、0.6、1.2 μg/mL），来探究维生素B12对圆型臂尾轮虫种群增长、繁殖和个体大小影响的最适浓度。本试验结果显示：添加维生素的试验组的轮虫数量和怀卵数量显著高于对照组（P<0.05），这说明维生素B12有可能通过促进细菌分泌物的活性，加速对水体营养物质的分解利用，促进细菌数量的迅速增长，大量的细菌不仅可以作为饵料为轮虫提供营养，而且可以有效净化水体环境。与此同时，维生素B12作为一种营养物质可以改善轮虫的新陈代谢从而促进轮虫的种群增长和繁殖。3～5 d浓度为0.3 μg/mL的维生素B12的轮虫数量显著高于其他组（P<0.05），2～4 d浓度为0.3 μg/mL的维生素B12的轮虫怀卵数量显著高于其他组（P<0.05），这说明维生素B12对轮虫种群增长和怀卵率影响的最适浓度为0.3 μg/mL。有研究表明维生素B12能促进萼花臂尾轮虫种群增长，并且该实验得出在25 ℃条件下，促进轮虫生长繁殖的最适浓度为1 μg/mL[19]。所以本實验是具有一定的实验依据的。此外，本试验还对轮虫的背甲长和宽进行测量，研究表明：0.3 μg/mL维生素B12组轮虫的背甲长和宽显著小于其他组（P>0.05），而其他三组差异不显著。探究出维生素B12对圆型臂尾轮虫种群增长、繁殖和个体大小影响的最适浓度，这为生产实践提供指导，有利于渔业更好更快的发展。当然本实验也存在着一些缺陷，没有将维生素B12的浓度梯度设置的特别精细，希望可以在今后的试验进一步探索。
关键词：圆型臂尾轮虫（Brachionus rotundiformis）;维生素B12;种群增长;怀卵率;个体大小
维生素B12又叫钴胺素，可促进甲基转移，具有活化氨基酸，促进核酸生物合成，促进蛋白质合成的重要作用。如鱼类缺乏维生素B12，可造成食欲不振、生长缓慢以及贫血等病症[1]。然而自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能合成维生素B12 [2]。
在水产动物苗种培育阶段，生物饵料是不可或缺的部分，直接影响到水产养殖业的效益和发展[3-5]。而轮虫，因其营养丰富，适应力强、繁殖迅速、易培养等特点，已然成为鱼类、甲壳动物培养初期的重要开口饵料，在海水养殖育苗阶段，目前尚无其他活饵可以替代[6]。不同发育阶段的幼苗对饵料营养需求有所不同，因此，近几年对于开口饵料的营养强化研究已成为一个新的热点，国内外专家对于轮虫的研究都逐渐深入[7-11]。近年来关于维生素B12对轮虫生长情况的影响有所研究[12-14]，但关于维生素B12对于圆型臂尾轮虫（Brachionus rotundiformis）的种群增长、繁殖和个体大小影响的研究至今没有报道。
本试验通过研究圆型臂尾轮虫在不同维生素B12浓度条件下对轮虫的种群增长、怀卵率，背甲长和宽的影响，来探究维生素B12对轮虫的最适浓度，进而在培养轮虫过程中，对轮虫进行营养强化，为苗种提供更优质的开口饵料，进一步促进水产养殖业的发展。
1材料与方法
1.1试验材料
海水圆型臂尾轮虫来自于东海水产研究所水产实验室;活性干酵母是由湖北安琪酵母股份有限公司所提供。维生素B12购买于北京奥博星生物技术责任有限公司，所有的实验仪器均来自东海水产研究所水产养殖室。
1.2试验材料的准备
1.2.1圆型臂尾轮虫的保种方法试验前，将轮虫置于10 L的广口瓶中进行培养（人工配制海水、盐度为20‰[15]），在培养的过程中，连续充气，自然光照，培养温度设为（25±1）℃，pH为7.3～7.8。以酵母溶液作为轮虫的饵料，每天投饵一次，饵料投喂量为8×106 cell/mL[16-17]。
1.2.2试验指标的测定方法每24 h从每个锥形瓶中随机取3 mL轮虫培养液，加碘液固定后计数每毫升培养液中轮虫数量、怀卵率。每隔一天从试验组中随机取2 mL轮虫培养液，用盐酸固定，测定每毫升培养液轮虫其背甲长和背甲宽。重复三次。取样在无菌操作台中进行。
怀卵率=卵个数/轮虫总数量×100%
1.3试验设计
试验分为对照组、维生素B12组，对照组为正常培养组，不添加维生素B12，维生素B12组添加不同浓度的B12（0.3、0.6、1.2 μg/mL）[18-19]。所有仪器在试验前均已灭菌，酵母投喂量为8×106 cell/mL，轮虫培养体积为1 L，培养过程中保持自然光照，连续充气，设定温度为（25±1）℃，pH为7.3～7.8。轮虫以250 ind/mL的接种密度接种到500 mL盐度为20‰的锥形瓶中，放置到生化培养箱中培养，温度设定为25 ℃。三重复。培养时不断充气。每日投喂两次酵母溶液。
1.4统计分析
应用单因子方差分析（LSD和Duncan）比较各试验组的背甲长宽的差异显著性，应用单因子方差分析（Tukey）比较各试验组生长数据的显著性，差异显著性水平（P）值设在0.05，所有统计分析均采用SPSS20.0统计软件。误差和置信区间用mean±SE表示[20]。
2结果
2.1不同维生素B12浓度对轮虫种群密度的影响
在培养前1～2 d，各组轮虫种群增长较缓慢，第3天开始增长得比较快，轮虫种群量在第5天达到峰值，随后下降。而维生素B12添加浓度为0.3 μg/L组的轮虫在第3天大幅度增加，第5天达到峰值后下降，最后轮虫数量高于其他各组。见图1。该试验结果表明：在培养早期（1～2 d）维生素B12对轮虫的种群增长无显著（P>0.05）影响;在培养的中期（3～5 d）维生素B12浓度为0.3 μg/mL组的轮虫的种群增长显著（P<0.05）高于其他组。
2.2不同维生素B12浓度对轮虫怀卵率的影响
轮虫怀卵量在第2天开始就增长得比较快，在第3天达到峰值，随后下降。而维生素B12添加浓度为0.3 μg/mL组的轮虫在第2天大幅度增加，第3天达到峰值后下降，最后轮虫怀卵量趋于第1天，见图2。该试验结果表明：在培养后期（6～7 d）维生素B12对轮虫的怀卵量无显著（P>0.05）影响;在培养的中期（2～5 d）维生素B12对轮虫怀卵量影响显著（P>0.05），维生素B12浓度为0.3 μg/mL组的轮虫的怀卵率显著（P<0.05）高于其他组。
2.3不同维生素B12浓度对圆型臂尾轮虫背甲长宽的影响
0.3 μg/mL维生素B12组轮虫的背甲长和宽显著小于其他组（P>0.05），而其他三组差异不显著。见图3、图4。
3讨论
维生素最早在水产上的应用是解决育苗过程中轮虫培养的问题，开始使用酵母培养轮虫时，经常会因为缺乏不饱和脂肪酸而导致鱼苗体质较弱，此后人们逐渐开始通过添加维生素来改变这种营养缺陷[21-23]。维生素在水产育苗方面占据着不可忽略的地位。维生素E对鱼类的生长繁殖起着非常重要的作用，它可以通过一些化学反应促进鱼类生长和提高饲料效率[24]，在鱼类养成期长期缺乏维生素E会导致血糖不稳定，并且影响性腺发育成熟[25]。维生素C具有非常强的抗氧化能力，它能够促进胚胎发育，提高精液和鱼卵的质量[26-27]。维生素A在保障机体正常免疫方面占据着非常重要的作用[28-29]，并且维生素A可用于改善贫血，提高血红蛋白水平。在培养轮虫的水溶液中加入适量的L-肉碱可以促进细菌的繁殖，细菌可以作为轮虫的饵料，从而促进轮虫的生长繁殖[30]。此细菌可以分泌维生素B12，所以本试验以海水圆型臂尾轮虫（Brachionusrotundiformis）作为研究对象，设置四种不同浓度的维生素B12（0.0、0.3、0.6、1.2 μg/mL），来探究维生素B12对圆型臂尾轮虫种群增长、繁殖和个体大小影响的最适浓度。本试验结果显示：添加维生素的试验组的轮虫数量和怀卵数量显著高于对照组（P<0.05），这说明维生素B12有可能通过促进细菌分泌物的活性，加速对水体营养物质的分解利用，促进细菌数量的迅速增长，大量的细菌不仅可以作为饵料为轮虫提供营养，而且可以有效净化水体环境。与此同时，维生素B12作为一种营养物质可以改善轮虫的新陈代谢从而促进轮虫的种群增长和繁殖。3～5 d浓度为0.3 μg/mL的维生素B12的轮虫数量显著高于其他组（P<0.05），2～4 d浓度为0.3 μg/mL的维生素B12的轮虫怀卵数量显著高于其他组（P<0.05），这说明维生素B12对轮虫种群增长和怀卵率影响的最适浓度为0.3 μg/mL。有研究表明维生素B12能促进萼花臂尾轮虫种群增长，并且该实验得出在25 ℃条件下，促进轮虫生长繁殖的最适浓度为1 μg/mL[19]。所以本實验是具有一定的实验依据的。此外，本试验还对轮虫的背甲长和宽进行测量，研究表明：0.3 μg/mL维生素B12组轮虫的背甲长和宽显著小于其他组（P>0.05），而其他三组差异不显著。探究出维生素B12对圆型臂尾轮虫种群增长、繁殖和个体大小影响的最适浓度，这为生产实践提供指导，有利于渔业更好更快的发展。当然本实验也存在着一些缺陷，没有将维生素B12的浓度梯度设置的特别精细，希望可以在今后的试验进一步探索。