采用血管平滑肌细胞(SM)特异性SM22α启动子/平滑肌肌球重链蛋白(SMHC)增强子,构建靶向大鼠哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)基因的干扰RNA真核表达载体,研究其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及移植血管新生内膜增生的影响。
方法构建大鼠特异性SM22α真核表达载体SM22α-p/e-mTOR-短发卡RNA(shRNA),建立大鼠颈静脉-动脉移植模型,在血管吻合完成后通过Pluronic F-127质粒缓释系统对血管内平滑肌增殖进行局部RNA干扰。实验分5组,每组20只SD大鼠。A组:对照组(25% Pluronic F-127组);B组:SM22α组(SM22α-p/e-m TOR-shRNA);C组:巨细胞病毒(CMV)组(CMV-p/e-m TOR-sh RNA);D组:阴性对照组(空质粒p Genesil-10);E组:阳性对照组;其中,B组和C组统称实验组。根据实验分组的不同,将含有50μg sh RNA质粒,或50μg渥曼青霉素(wortmannin)凝胶,或单纯200μl 25% Pluronic F-127凝胶均匀涂抹在移植静脉周围,分别于术后1、3、7、14 d获取移植血管。苏木素-伊红(HE)染色观察新生内膜厚度;免疫组织化学检测平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)、增殖细胞核抗原(PCNA)、磷酸化-m TOR(Ser2448),原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡,评估m TOR信号通路的变化以及平滑肌细胞的增殖。
结果术后7 d各组新生内膜厚度差异有统计学意义(P<0. 05);术后14 d,A组新生内膜较术后1 d增厚12. 4倍;B、C、D、E组分别增厚9. 7、4. 8、7. 6、2. 6倍。术后14 d,各实验组和阳性对照组移植静脉α-SM-actin表达阳性面积均明显低于对照组(P< 0. 05),PCNA阳性表达面积均低于对照组(P< 0. 05),磷酸化-m TOR(Ser2448)阳性表达面积均低于对照组(P< 0. 05);实验组、对照组、阴性对照组术后移植静脉凋亡细胞阳性面积比较差异无统计学意义(P> 0. 05),阳性对照组凋亡面积明显高于其他组(P< 0. 05)。
结论SM22α-p/e-m TOR-shRNA可通过抑制血管平滑肌细胞m TOR信号通路而抑制血管平滑肌细胞增殖,预防或延缓移植静脉狭窄。