论文部分内容阅读
摘要： 類糖原合成酶激酶（SKs）属于丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，在植物器官发育、激素信号传导过程中十分重要，并参与生物胁迫、非生物胁迫的应答过程。大叶落地生根中的胎生苗发育过程，同时具备胚胎发生和器官发生的特征，是研究无性生殖的理想模型。为了更好地理解大叶落地生根中胎生苗发育的分子机制，该研究利用RACEPCR技术，从大叶落地生根中克隆了1个新的基因KdSK。该基因具有423个氨基酸残基，分子量为47.79 kD，等电点为8.37，其开放阅读框长为1 272 bp。其蛋白与黄瓜的同源性最高，属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ类，与苜蓿（MSK4）蛋白在进化关系上最近，且与拟南芥（AtSK41、AtKSK42）聚为一枝。保守域结构分析表明，KdSK蛋白具有明显的蛋白激酶的结构域，包括蛋白激酶的ATP结构域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化结构域。实时荧光定量PCR分析表明，该蛋白基因在大叶落地生根的根中表达量最高，且受渗透胁迫（甘露醇）的诱导上调表达。该研究首次从大叶落地生根中克隆出KdSK基因，该研究结果为进一步研究该基因的功能打下了基础。
关键词： 大叶落地生根， 类糖原合成酶激酶， 基因克隆， 序列分析， 基因表达
中图分类号： Q943.2文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）08102510
（ 1. Shenzhen Risheng Landscape Co. Ltd.， Shenzhen 518040， Guangdong， China； 2. Shenzhen Tourism College， Jinan University，
Shenzhen 518053， Guangdong， China； 3. Turfgrass Research Institute， Beijing Forestry University， Beijing 1000083， China；
4. College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangdong
Engineering Research Center of Grassland Science， Guangzhou 510642， China ）
Abstract： Shaggylike protein kinase（SKs） plays numerous roles during the plant development， such as organ development， phytohormone conduction， abiotic stress and biotic stress. Kalanchoe daigremontiana is an attractive model system for the study of the molecular mechanisms of somatic embryogenesis and organogenesis competence because of its ability to form embryos and to acquire organogenic competence through plantlets. To better understand the molecular mechanisms of plantlet formation involved in K. daigremontiana， a shaggylike protein kinase， KdSK， was identified using rapid amplification of cDNA end （RACE） PCR. KdSK gene consists of an ORF of 1 272 bp that was predicted to encode a 483 amino acid residuelong protein of 47.79 kD with an isoelectric point of 8.37. The sequence analysis of the KdSK revealed homology to Cucumis sativus shaggyrelated protein kinase kappa. Phylogenetic analysis showed that KdSK gene was closely related to Medicage sativa protein（MSK4） and formed a subgroup with Arabidopsis thaliana（AtSK41， AtKSK42）， all clustered to Clade Ⅳof GSK3/shaggy kinases family. Conservation domain structure analysis indicated that KdSK protein had typical structure of the protein kinase domain， including ATP domain and Serine/Threonine protein kinases activesite signature. Realtime PCR analysis revealed that KdSK transcript was expressed the highest in root and upregulated under osmotic stress. This study characterized the novel KdSK gene from Kalanchoe daigremontiana for the first time and the results will be useful for further functional determination of the gene. Key words： Kalanchoe daigremontiana， shaggylike kinase， gene clone， sequence analysis， gene expression
植物中的类糖原合成酶激酶（Shaggylike kinase，SK）是果蝇（Drosophila melanogaster） shaggy（SGG）基因和哺乳动物中糖原合成酶激酶（GlycogenSynthase Kinase3，GSK3）的同源物，同属于丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。在模式植物拟南芥中，AtSK基因家族中的10个家族成员，被分为四类。AtSK11、AtSK12、AtSK13属于I类；AtSK21、AtSK22、AtSK23属于Ⅱ类；AtSK31、AtSK32属于Ⅲ类，AtSK41、AtSK42属于Ⅳ类 （Yoo et al， 2006）。此外，从其他植物中也相继克隆出SK基因（Qi et al， 2013； Tichtinsky et al，1998）。果蝇中，SGG基因参与无翅性状的信号传导（Bourouis et al， 1990； Siegfried et al， 1990），控制着正常的细胞分裂以及胚胎发育过程中细胞分化方向（Nusse，1999； Skaer，1998）。与SGG类似，植物中的SK基因在器官发育、信号传导、伤害应答等方面都有非常重要的作用，而且不同种类的SK基因功能也不同（MillsLujan et al， 2015）。AtSK11、AtSK12可以调节花在不同階段的发育模式，反义表达AtSK11、AtSK12特异片段的转基因植物，花被数增加，且雌蕊群的发育也发生改变（Dornelas et al， 2000）。AtSK32突变体表现出更小的花梗、花萼和花瓣，花器官中细胞较小，细胞壁扩展酶-三木葡聚糖转录水平降低，表明AtSK32参与细胞伸长，在花发育调控中有重要作用（Claisse et al， 2007）。
BZR1/BES1是油菜素内酯（BRs）反应中的正调控因子，在BRs途径中诱导BZR1/BES1的脱磷酸作用和积累。AtSK21在BRs反应中是一个负调控因子，AtSK21磷酸化BZR1/BES1使其降解，从而抑制下游的信号传导反应（He et al， 2002）。过表达AtSK22的植株，能诱导盐胁迫反应基因AtCBL1和AtCP1的表达和花色素苷积累，进而改变细胞内的阳离子浓度，增强拟南芥耐盐和耐干旱能力（Piao et al， 2001）。小立碗藓中的5个PpSKs，对脱水、PEG、山梨醇都有响应（Richard et al， 2005）。高盐胁迫下，紫花苜蓿中Msk4激酶被快速诱导，过表达该基因能改善对盐胁迫的耐受力（Kempa et al， 2007）。
植物中的SK基因在器官发育和逆境胁迫中的重要作用已有报道，但大叶落地生根作为一种常见的园艺植物，人们对其独特的繁殖模式机制却知之甚少，大叶落地生根通过胎生苗进行繁殖，胎生苗的发生过程同时具有胚胎发生和器官发生的特征，被认为是研究无性生殖的理想模型。为了探究大叶落地生根的无性生殖模型，利用抑制消减杂交技术（SSH）构建了大叶落地生根胎生苗和普通叶片的SSHcDNA文库，并从该文库中筛选出一条与SK基因片段同源的表达序列标签（EST）（Zhong et al， 2013； Rensing， 2016）。本研究以该EST片段为基础，采用RACEPCR技术克隆出大叶落地生根SK的cDNA基因全长（命名为KdSK），利用生物信息学方法分析KdSK基因的序列、蛋白结构、系统发育，并研究该基因在大叶落地生根不同组织和渗透胁迫诱导下的表达变化，为该基因的进一步研究利用打下了基础。
1材料与方法
1.1 材料的培养
大叶落地生根（Kalanchoe daigremontiana）种植于北京林业大学草坪研究所温室中，培养基质为腐叶土、蛭石和珍珠岩按4∶2∶1混合，在16 h光照/8 h黑暗、光照强度25 μmol·m2·s1、温度 （30±3） ℃下培养。采集叶片后快速在液氮中固定，置于-80 ℃超低温冰箱保存。
1.2 总RNA的提取及反转录
使用TaKaRa MiniBEST universal RNA Extraction Kit （Code No. 9769）提取落地生根叶片的总RNA，并在-80 ℃下保存。
1.3 KdSK基因的克隆和测序
根据差减文库的测序结果，分别设计上游引物F1： 5′GGGGGAGCAGGCAGTTCTAGGA3′和下游引物R1： 5′ACTTATTTGGTAAAGCAAGCCG3′。以总RNA为模板，按照PrimeScript TM Ⅱ High Fidelity RTPCR Kit（Takara Code No.RO23A）的操作说明合成第一链cDNA，使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No.R060A）进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL，包括1 μL cDNA模板，1 μL Tks Gflex DNA Polymerase（1.25 u·μL1），F1 Primer （20 μmol·L1） 1 μL，R1 Primer （20 μmol·L1）） 1 μL，2 × Gflex Buffer （mg 2+，dNTP plus） 25 μL，dH2O 21 μL。反应程序为98 ℃变性 10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃ 延伸1 min，共30个循环。以上述PCR产物为模板，进行二次PCR，反应体系及条件同上。取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0 （Code No. 9762）回收，用R1为特异引物对回收后的DNA测序。 根据获得的KdSK基因cDNA片段序列设计5′RACE Outer PCR特异引物R01： 5′ TGATATCCCGGTGGCATATACC3′和Inner PCR R02： 5′ ATTTCGCTTGGACAACAACACC3′。使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech Cat. No. 634923）反转录总RNA合成cDNA。使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No. R060A）进行PCR扩增。Outer PCR反应完成后，立即取反应液1 μL进行Inner PCR反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0 （Code No. 9762）回收。接着用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2.1 （Code No.6022）中的连接酶，将PCR产物与TVector pMDTM 18 （Code No.3271）进行连接，热转化至大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞JM109 （Code No. 9052）中，涂布平板，37 ℃过夜培养。挑选阳性菌落，提取质粒，用引物M1347引物对进行测序。
根据获得的KdSK基因cDNA片段序列设计3′RACE Outer PCR特异引物F01：5′ GGGCATGTCATAAGAACTACAA3′和Inner PCR特异引物F02：5′ TAAGCGTTACAAAAACCGAGAG 3′。以1 μL的RNA為模板，使用3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase （Code No. 6106）反转录合成cDNA。使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No. R060A）进行PCR反应。两轮PCR反应完成后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳。经胶回收和连接克隆，用M1347引物对质粒进行测序分析。具体步骤同5′RACE。
对KdSK基因的cDNA片段的5′端和3′序列进行拼接，获得KdSK基因的全长序列。并分别设计上游引物YZF1： 5′TGGACAAAAGTGCGCACTCCT3′；YZF2： 5′GGTGACCAGCGGCGACTTAA3′。下游引物 YZR1： 5′TGAAAGTCAGAGTGGCATCTCT3′。以验证试验中使用的cDNA为模板，进行两轮PCR反应。第一轮PCR反应使用引物YZF1和YZR1。第二轮PCR反应使用YZF2和YZR1。使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No.R060A）进行PCR扩增。取5 μL PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳。用YZF2、YZR1引物进行测序分析。
1.4 KdSK基因的生物信息学分析
应用NCBI数据库中ORF Finder软件寻找KdSK序列中的ORF，推导编码的氨基酸序列。应用Expasy的ScanProstie、ProtParam、TMpred、Protscale程序分析KdSK蛋白的保守结构域、分子量和等电点、跨膜结构域和亲疏水性（Gasteiger et al，2005）。用BLAST程序检索相似蛋白，利用ClustalX 2.1 软件对不同物种的氨基酸序列进行多重比对（Larkin et al， 2007）；利用MEGA 6.0分析氨基酸序列，用邻接法构建进化树，并用bootstrap校正（Tamura et al， 2007）；根据NPS@ web server网站中的PHD方法预测蛋白的二级结构（Combet et al， 2000）。应用在线分析工具Phyre分析SAHH蛋白三级结构（Kelley & Sternberg， 2009）。
1.5 KdSK表达的荧光定量分析
以大叶落地生根actin作为内参基因，根据KdSK的序列信息设计荧光定量的上游引物F1：5′TACAAAAACCGAGAGCTACAGA3′，下游引物R1：5′CAAAGGAATTCGTTGATGGA3′。以大叶落地生根中的根、茎、叶、叶柄为总RNA材料分析KdSK基因在不同组织中的表达情况。对大叶落地生根幼苗进行渗透胁迫处理（300 mmol·L1甘露醇），分别在处理的0、3、6、9、12、24 h采集叶位相同的叶片，每个处理设3个重复，3个重复混合取样，提取总RNA分析KdSK基因在渗透胁迫下的表达情况。按照Ist Strand cDNA Synthesis Kit （Takara）试剂盒操作说明合成cDNA，根据SYBR FAST qPCR Kit Master Mix （2×） Universal （KAPA Biosystems）试剂盒进行PCR扩增。荧光定量反应体系为SYBR FAST qPCR Kit Master Mix（2×） Universal 5 μL，上下游引物（10 μmol·L1） 各0.2 μL，cDNA 1 μL，ROX校正染料 0.2 μL，dH2O 3.4 μL，共10 μL。反应在ABI7900HT实时定量PCR仪上进行，反应条件为95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s。采用2-ΔΔCT法分析结果。
2结果与分析
2.1 KdSK cDNA克隆与测序
以大叶落地生根叶片第一链cDNA为模板，并用引物F1和R1进行PCR扩增，获得约1 000 bp的目的片段（图1：A）。根据获得的SK基因cDNA片段序列分别设计3′RACE和5′ RACE特异引物，获得约1 200 bp和500 bp的目的片段（图1：B， 图1：C）。将获得的cDNA片段的5′端和3′端序列进行拼接，以大叶落地生根叶片第一链cDNA为模板，设计验证引物，获得约1 800 bp的目的片段（图1：D）。因此，大叶落地生根SK基因的cDNA全长为1 712 bp （GenBank登录号：KU740358），命名为KdSK，含有1 272 bp完整开放阅读框（ORF），编码 423个氨基酸（图2），不包括PolyA尾的长度为1 700 bp，5′UTR（非编码区）238 bp，3′UTR 190 bp。 2.2 KdSK序列分析及系统进化树的构建
KdSK与黄瓜（XP_004147888.1）、胡杨（XP_011028359.1）、木本棉（KHF99017.1）、荷花（XP_010245513.1）、菠菜（KNA20150.1）的相似性分别为90%、89%、88%、87%、86%。通过ScanProsite在线软件分析，发现该蛋白具有明显的蛋白激酶的结构域（82～366），其中包括蛋白激酶ATP结构域（88～112）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化结构域（203～215）。
通过SIB中的Motif Scan，预测得到一些不同的基序，包括2个Nglycosylation site （239～242、313～316）、7个Casein kinase II phosphorylation site （23～26、49～52、144～147、262～265、287～290、303～306、356～359）、5个MYRISTYL Nmyristoylation site （7～12、20～25、58～63、70～75、270～275）、5个Protein kinase C phosphorylation site （3～5、11～13、146～148、229～231、373～375）、1个Tyrosine kinase phosphorylation site（112～119）、1个Protein tyrosine kinase（82～141）。
SK序列进行了氨基酸序列比对。从图3可以看出，不同植物SK氨基酸序列在几个重要功能位点的序列保守性程序很高，如蛋白激酶ATP结合区域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点。为了明确大叶落地生根KdSK与其他植物中蛋白激酶的进化关系，选取了6种植物中的26条SK蛋白序列进行分析。
利用Mega 6.0中的相邻连接法构建系统进化树（图4），采用默认参数，自检举1 000次，对生成的系统树进行Bootstrap校正。结果表明，这26条SK蛋白分为2个大枝，其中KdSK属于第一大枝，隶属于第二分枝。与拟南芥（AtSK31、AtSK32）、烟草（NSK111、NSK6、NSK91）、矮牵牛（PSK6、SPSK6、PSK7、PSK4）、小立碗藓（PpSK5、PpSK1、PpSK2）的亲缘关系都较远，而与苜蓿（MSK4）蛋白在进化关系最近，并且与拟南芥（AtSK41、AtSK42）属于同一大枝。由此推测，KdSK可能参与到渗透胁迫途径。
2.3 KdSK的理化性质及三级结构预测
KdSK蛋白的理论分子量为47.79 kD，理论等电点为8.37。脂溶指数为85.04，总平均亲水性（GRAVY）为-0.303，不稳定系数为34.09，表明该蛋白是一个稳定的蛋白。二级结构预测结果（图5）表明，KdSK含有30.97%的α螺旋，21.75%的β折叠和47.28%的随机卷曲，没有信号肽及其剪切位点，是水溶性的非分泌型蛋白，有3个明显的跨膜区（表1），被定位于细胞核中（预测精度为83%）。
通过Phyre在线预测网站预测的三维结构表明，KdSK蛋白分为2个部分，其中一个部分主要由α螺旋构成，另外两个部分由α螺旋和β折叠共同构成。一共有10个α螺旋和8个β折叠（图6：A）。KdSK蛋白中的259个氨基酸（占总氨基酸序列的61%），完全比对到G蛋白偶联受体激酶（GRK5）的A链上（图6：B）。
2.4 KdSK的组织表达分析
利用荧光实时定量PCR对KdSK在大叶落地生根中的表达情况进行检测，结果如图7所示，KdSK在根中表达量最高。表达量由高到低依次为根>茎>叶>叶柄。这些结果表明，KdSK在各组织中均有表达，但不具有组织特异性，主要在大叶落地生根的根部行使功能。
2.5 KdSK的誘导表达分析
用300 mmol·L1甘露醇对大叶落地生根进行渗透胁迫，以实时荧光定量PCR法分析其表达动态。图8结果显示，KdSK在甘露醇处理下存在先下降后上升再次下降而后上升的表达趋势。在处理 6 h时，KdSK的表达量达到最大值。随着处理时间的增加，KdSK的表达量出现剧烈变化之后，随后趋于平衡的状态。
3讨论
大叶落地生根类糖原合成激酶KdSK基因，通过NCBIBLAST的同源性比对，发现其氨基酸序列与黄瓜（XP_004147888.1）的相似性最高，该黄瓜序列是AtSK41的同源序列。利用相邻连接法构建进化树，可分为2大亚枝，KdSK蛋白属于第1大亚枝的第二分枝，与MSK4、AtSK41、AtSK42共同构成该分枝。这些结果都说明KdSK属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ类。KdSK蛋白与来自拟南芥、小立碗藓、苜蓿、小麦、烟草、矮牵牛中的同源蛋白进行多序列比对，发现该蛋白激酶的催化区序列非常保守，但是N端和C端的序列差异很大，同源性较低，表明不同的SKs可能通过不同的末端序列调节不同的生物过程。
KdSK蛋白有一个较小的N端区域和一个较大的C端区域，N端区域由1个α螺旋和6个反平行的β折叠构成，C端区域主要由α螺旋构成（孙浩等，2009）。ATP（三磷酸腺苷）结合口袋位于N端区域和C端区域的结合部，保守的Tyr残基是该蛋白的关键位点，在拟南芥中研究表明，该残基参与了拟南芥GSKs的磷酸化过程（DE LA Fuente Van Bentem et al， 2008）。在KdSK氨基酸序列中有一个丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性位点（位置为203～215），表明KdSK蛋白是一个丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。GSK3Shaggy激酶是盘基网柄菌建立极性必须的（Harwood et al， 1995），同样在维持非洲爪蟾胚胎的对称性中发挥重要作用（He et al， 1995）。果蝇中胚胎边界（Siegfried et al， 1992）和神经系统（Ruel et al， 1993）的空间结构也需要GSK3Shaggy激酶的参与。这说明KdSK蛋白很有可能参与到大叶落地生根胎生苗发育过程中的胚胎发生过程。 在不同組织中KdSK的表达量不同，暗示着KdSK可能参与了植物器官发育的调控，其中，在根中表达量最高，这也暗示着它主要在根中行使功能。在胁迫（甘露醇）处理下，KdSK基因在3h出现一个短暂的下降，随后在6 h表达量达到最高，随着时间的延长，表达量逐渐下降。Charrier（2002）等的研究表明，拟南芥Shaggylike家族中，AtSK42基因能够被高盐和渗透胁迫诱导，AtSK42基因表达量上调2倍以上，而在黑暗条件下，AtSK42基因表达下调4倍。KdSK基因属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ类，在渗透胁迫（甘露醇处理）下，表达量大量升高，暗示着KdSK基因极有可能参与大叶落地生根抗逆胁迫反应中。本研究对大叶落地生根类糖原合成激酶进行克隆和生物信息学分析，定量分析结果表明，KdSK基因可能参与到渗透胁迫的响应中，关于KdSK是否在大叶落地生根中参与胚胎建成、抗逆胁迫响应途径还需要进一步的实验进行验证。
参考文献：
BOUROUIS M， MOORE P， RUEL L， et al， 1990. An early embryonic product of the gene shaggy encodes a serine/threonine protein kinase related to the CDC28/cdc2+ subfamily [J]. Emb J， 9（9）：2877-2884.
CHARRIER B， 2002. Expression profiling of the whole Arabidopsis shaggylike kinase multigene family by realtime reverse transcriptasepolymerase chain reaction [J]. Plant Physiol， 130（2）：577-590.
CLAISSE G， CHARRIER B， KREIS M， 2007. The Arabidopsis thaliana GSK3/Shaggy like kinase AtSK32 modulates floral cell expansion [J]. Plant Mol Biol， 64（1-2）：113-124.
COMBET C， BLANCHET C， GEOURJON C， et al， 2000. NPS@： network protein sequence analysis [J]. Trends Biochem Sci， 25（3）：147-150.
DE LA FUENTE VAN BENTEM S， ANRATHER D， DOHNAL I， et al， 2008. Sitespecific phosphorylation profiling of Arabidopsis proteins by mass spectrometry and peptide chip analysis.[J]. J Prot Res， 7（6）：2458-2470.
DORNELAS MC， Van LAMMEREN AA， KREIS M， 2000. Arabidopsis thaliana SHAGGYrelated protein kinases （AtSK11 and 12） function in perianth and gynoecium development [J]. Plant J， 21（5）：419-429.
GASTEIGER E， HOOGLAND C， GATTIKER A， et al， 2005. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server [M]//WALKER JM. The Proteomics Protocols Handbook. Totowa， NJ： Humana Press： 571-607.
HARWOOD AJ， PLYTE SE， WOODGETT J， et al， 1995. Glycogen synthase kinase 3 regulates cell fate in dictyostelium [J]. Cell， 80（1）：139-148.
HE JX， GENDRON JM， YANG Y， et al， 2002. The GSK3like kinase BIN2 phosphorylates and destabilizes BZR1， a positive regulator of the brassinosteroid signaling pathway in Arabidopsis [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 99（15）：10185-10190.
HE X， SAINTJEANNET JP， WOODGETT JR， et al， 1995. Glycogen synthase kinase3 and dorsoventral patterning in Xenopus embryos [J]. Nature， 374（6523）：617-622.
KELLEY LA， STERNBERG MJE， 2009. Protein structure prediction on the Web： a case study using the Phyre server [J]. Nat Protoc， 4（3）：363-371.
KEMPA S， ROZHON W， AMAJ J， et al， 2007. A plastidlocalized glycogen synthase kinase 3 modulates stress tolerance and carbohydrate metabolism [J]. Plant J， 49（6）：1076-1090. LARKIN MA， BLACKSHIELDS G， BROWN NP， et al， 2007. Clustal W and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics， 23（21）：2947-2948.
MILLSLUJAN K， ANDREWS DL， CHOU C， et al， 2015. The roles of phosphorylation and SHAGGYLike protein kinases in geminivirus C4 protein induced hyperplasia [J]. PLoS ONE， 10（3）：e122 356.
NUSSE R， 1999. WNT targets. Repression and activation [J]. Trends Genet， 15（1）：1-3.
PIAO HL， LIM JH， KIM SJ， et al， 2001. Constitutive overexpression of AtGSK1 induces NaCl stress responses in the absence of NaCl stress and results in enhanced NaCl tolerance in Arabidopsis [J]. Plant J， 27（4）：305-314.
QI X， CHANDERBALI AS， WONG GK， et al， 2013. Phylogeny and evolutionary history of glycogen synthase kinase 3/SHAGGYlike kinase genes in land plants [J]. Bmc Evol Biol， 13：143.
RENSING SA， 2016. （Why） Does evolution favour embryogenesis？ [J]. Trends Plant Sci， 21（7）：562-573.
RICHARD O， PAQUET N， HAUDECOEUR E， et al， 2005. Organization and expression of the GSK3/Shaggy kinase gene family in the moss physcomitrella patens suggest early gene multiplication in land plants and an ancestral response to osmotic stress [J]. J Mol Evol， 61（1）：99-113.
RUEL L， BOUROUIS M， HEITZLER P， et al， 1993. Drosophila shaggy kinase and rat glycogen synthase kinase3 have conserved activities and act downstream of Notch [J]. Nature， 362（6420）：557-560.
SUN H， JIANG J， YU QS， et al， 2009. Molecular dynamics simulation of significant roles of structural water molecules in glycogen synthase kinase3β [J]. Acta Physicochimica Sin，25（4）：635-639. [孫浩， 蒋勇军， 俞庆森，等， 2009. 分子动力学模拟方法研究结构水在糖原合成酶激酶-3β中的作用[J]. 物理化学学报， 25（4）：635-639.]
SIEGFRIED E， CHOU TB， PERRIMON N， 1992. Wingless signaling acts through zestewhite 3， the drosophila homolog of glycogen synthase kinase3， to regulate engrailed and establish cell fate [J]. Cell， 71（7）：1167-1179.
SIEGFRIED E， PERKINS LA， CAPACI TM， et al， 1990. Putative protein kinase product of the drosophila segmentpolarity gene zestewhite3 [J]. Nature， 345（6278）：825-829.
SKAER H， 1998. Who pulls the string to pattern cell division in drosophila？ [J]. Trends Genet， 14（9）：337-339.
TAMURA K， DUDLEY J， NEI M， et al， 2007. MEGA4： molecular evolutionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0 [J]. Mol Biol Evol， 24（8）：1596-1599.
TICHTINSKYG， TAVARES R， TAKVORIAN A， et al， 1998. An evolutionary conserved group of plant GSK3/shaggylike protein kinase genes preferentially expressed in developing pollen [J]. Biochim Biophys Acta， 1442（2-3）：261-273.
YOO MJ， ALBERT VA， SOLTIS PS， et al， 2006. Phylogenetic diversification of glycogen synthase kinase 3/SHAGGYlike kinase genes in plants [J]. Bmc Plant Biol， 6：3.
ZHONG T， ZHU C， ZENG H， et al， 2013. Analysis of gene expression in Kalanchoe daigremontiana leaves during plantlet formation under drought stress [J]. Electron J Biotechnol， 16： 4.
关键词： 大叶落地生根， 类糖原合成酶激酶， 基因克隆， 序列分析， 基因表达
中图分类号： Q943.2文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）08102510
（ 1. Shenzhen Risheng Landscape Co. Ltd.， Shenzhen 518040， Guangdong， China； 2. Shenzhen Tourism College， Jinan University，
Shenzhen 518053， Guangdong， China； 3. Turfgrass Research Institute， Beijing Forestry University， Beijing 1000083， China；
4. College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangdong
Engineering Research Center of Grassland Science， Guangzhou 510642， China ）
Abstract： Shaggylike protein kinase（SKs） plays numerous roles during the plant development， such as organ development， phytohormone conduction， abiotic stress and biotic stress. Kalanchoe daigremontiana is an attractive model system for the study of the molecular mechanisms of somatic embryogenesis and organogenesis competence because of its ability to form embryos and to acquire organogenic competence through plantlets. To better understand the molecular mechanisms of plantlet formation involved in K. daigremontiana， a shaggylike protein kinase， KdSK， was identified using rapid amplification of cDNA end （RACE） PCR. KdSK gene consists of an ORF of 1 272 bp that was predicted to encode a 483 amino acid residuelong protein of 47.79 kD with an isoelectric point of 8.37. The sequence analysis of the KdSK revealed homology to Cucumis sativus shaggyrelated protein kinase kappa. Phylogenetic analysis showed that KdSK gene was closely related to Medicage sativa protein（MSK4） and formed a subgroup with Arabidopsis thaliana（AtSK41， AtKSK42）， all clustered to Clade Ⅳof GSK3/shaggy kinases family. Conservation domain structure analysis indicated that KdSK protein had typical structure of the protein kinase domain， including ATP domain and Serine/Threonine protein kinases activesite signature. Realtime PCR analysis revealed that KdSK transcript was expressed the highest in root and upregulated under osmotic stress. This study characterized the novel KdSK gene from Kalanchoe daigremontiana for the first time and the results will be useful for further functional determination of the gene. Key words： Kalanchoe daigremontiana， shaggylike kinase， gene clone， sequence analysis， gene expression
植物中的类糖原合成酶激酶（Shaggylike kinase，SK）是果蝇（Drosophila melanogaster） shaggy（SGG）基因和哺乳动物中糖原合成酶激酶（GlycogenSynthase Kinase3，GSK3）的同源物，同属于丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。在模式植物拟南芥中，AtSK基因家族中的10个家族成员，被分为四类。AtSK11、AtSK12、AtSK13属于I类；AtSK21、AtSK22、AtSK23属于Ⅱ类；AtSK31、AtSK32属于Ⅲ类，AtSK41、AtSK42属于Ⅳ类 （Yoo et al， 2006）。此外，从其他植物中也相继克隆出SK基因（Qi et al， 2013； Tichtinsky et al，1998）。果蝇中，SGG基因参与无翅性状的信号传导（Bourouis et al， 1990； Siegfried et al， 1990），控制着正常的细胞分裂以及胚胎发育过程中细胞分化方向（Nusse，1999； Skaer，1998）。与SGG类似，植物中的SK基因在器官发育、信号传导、伤害应答等方面都有非常重要的作用，而且不同种类的SK基因功能也不同（MillsLujan et al， 2015）。AtSK11、AtSK12可以调节花在不同階段的发育模式，反义表达AtSK11、AtSK12特异片段的转基因植物，花被数增加，且雌蕊群的发育也发生改变（Dornelas et al， 2000）。AtSK32突变体表现出更小的花梗、花萼和花瓣，花器官中细胞较小，细胞壁扩展酶-三木葡聚糖转录水平降低，表明AtSK32参与细胞伸长，在花发育调控中有重要作用（Claisse et al， 2007）。
BZR1/BES1是油菜素内酯（BRs）反应中的正调控因子，在BRs途径中诱导BZR1/BES1的脱磷酸作用和积累。AtSK21在BRs反应中是一个负调控因子，AtSK21磷酸化BZR1/BES1使其降解，从而抑制下游的信号传导反应（He et al， 2002）。过表达AtSK22的植株，能诱导盐胁迫反应基因AtCBL1和AtCP1的表达和花色素苷积累，进而改变细胞内的阳离子浓度，增强拟南芥耐盐和耐干旱能力（Piao et al， 2001）。小立碗藓中的5个PpSKs，对脱水、PEG、山梨醇都有响应（Richard et al， 2005）。高盐胁迫下，紫花苜蓿中Msk4激酶被快速诱导，过表达该基因能改善对盐胁迫的耐受力（Kempa et al， 2007）。
植物中的SK基因在器官发育和逆境胁迫中的重要作用已有报道，但大叶落地生根作为一种常见的园艺植物，人们对其独特的繁殖模式机制却知之甚少，大叶落地生根通过胎生苗进行繁殖，胎生苗的发生过程同时具有胚胎发生和器官发生的特征，被认为是研究无性生殖的理想模型。为了探究大叶落地生根的无性生殖模型，利用抑制消减杂交技术（SSH）构建了大叶落地生根胎生苗和普通叶片的SSHcDNA文库，并从该文库中筛选出一条与SK基因片段同源的表达序列标签（EST）（Zhong et al， 2013； Rensing， 2016）。本研究以该EST片段为基础，采用RACEPCR技术克隆出大叶落地生根SK的cDNA基因全长（命名为KdSK），利用生物信息学方法分析KdSK基因的序列、蛋白结构、系统发育，并研究该基因在大叶落地生根不同组织和渗透胁迫诱导下的表达变化，为该基因的进一步研究利用打下了基础。
1材料与方法
1.1 材料的培养
大叶落地生根（Kalanchoe daigremontiana）种植于北京林业大学草坪研究所温室中，培养基质为腐叶土、蛭石和珍珠岩按4∶2∶1混合，在16 h光照/8 h黑暗、光照强度25 μmol·m2·s1、温度 （30±3） ℃下培养。采集叶片后快速在液氮中固定，置于-80 ℃超低温冰箱保存。
1.2 总RNA的提取及反转录
使用TaKaRa MiniBEST universal RNA Extraction Kit （Code No. 9769）提取落地生根叶片的总RNA，并在-80 ℃下保存。
1.3 KdSK基因的克隆和测序
根据差减文库的测序结果，分别设计上游引物F1： 5′GGGGGAGCAGGCAGTTCTAGGA3′和下游引物R1： 5′ACTTATTTGGTAAAGCAAGCCG3′。以总RNA为模板，按照PrimeScript TM Ⅱ High Fidelity RTPCR Kit（Takara Code No.RO23A）的操作说明合成第一链cDNA，使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No.R060A）进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL，包括1 μL cDNA模板，1 μL Tks Gflex DNA Polymerase（1.25 u·μL1），F1 Primer （20 μmol·L1） 1 μL，R1 Primer （20 μmol·L1）） 1 μL，2 × Gflex Buffer （mg 2+，dNTP plus） 25 μL，dH2O 21 μL。反应程序为98 ℃变性 10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃ 延伸1 min，共30个循环。以上述PCR产物为模板，进行二次PCR，反应体系及条件同上。取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0 （Code No. 9762）回收，用R1为特异引物对回收后的DNA测序。 根据获得的KdSK基因cDNA片段序列设计5′RACE Outer PCR特异引物R01： 5′ TGATATCCCGGTGGCATATACC3′和Inner PCR R02： 5′ ATTTCGCTTGGACAACAACACC3′。使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech Cat. No. 634923）反转录总RNA合成cDNA。使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No. R060A）进行PCR扩增。Outer PCR反应完成后，立即取反应液1 μL进行Inner PCR反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0 （Code No. 9762）回收。接着用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2.1 （Code No.6022）中的连接酶，将PCR产物与TVector pMDTM 18 （Code No.3271）进行连接，热转化至大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞JM109 （Code No. 9052）中，涂布平板，37 ℃过夜培养。挑选阳性菌落，提取质粒，用引物M1347引物对进行测序。
根据获得的KdSK基因cDNA片段序列设计3′RACE Outer PCR特异引物F01：5′ GGGCATGTCATAAGAACTACAA3′和Inner PCR特异引物F02：5′ TAAGCGTTACAAAAACCGAGAG 3′。以1 μL的RNA為模板，使用3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase （Code No. 6106）反转录合成cDNA。使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No. R060A）进行PCR反应。两轮PCR反应完成后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳。经胶回收和连接克隆，用M1347引物对质粒进行测序分析。具体步骤同5′RACE。
对KdSK基因的cDNA片段的5′端和3′序列进行拼接，获得KdSK基因的全长序列。并分别设计上游引物YZF1： 5′TGGACAAAAGTGCGCACTCCT3′；YZF2： 5′GGTGACCAGCGGCGACTTAA3′。下游引物 YZR1： 5′TGAAAGTCAGAGTGGCATCTCT3′。以验证试验中使用的cDNA为模板，进行两轮PCR反应。第一轮PCR反应使用引物YZF1和YZR1。第二轮PCR反应使用YZF2和YZR1。使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No.R060A）进行PCR扩增。取5 μL PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳。用YZF2、YZR1引物进行测序分析。
1.4 KdSK基因的生物信息学分析
应用NCBI数据库中ORF Finder软件寻找KdSK序列中的ORF，推导编码的氨基酸序列。应用Expasy的ScanProstie、ProtParam、TMpred、Protscale程序分析KdSK蛋白的保守结构域、分子量和等电点、跨膜结构域和亲疏水性（Gasteiger et al，2005）。用BLAST程序检索相似蛋白，利用ClustalX 2.1 软件对不同物种的氨基酸序列进行多重比对（Larkin et al， 2007）；利用MEGA 6.0分析氨基酸序列，用邻接法构建进化树，并用bootstrap校正（Tamura et al， 2007）；根据NPS@ web server网站中的PHD方法预测蛋白的二级结构（Combet et al， 2000）。应用在线分析工具Phyre分析SAHH蛋白三级结构（Kelley & Sternberg， 2009）。
1.5 KdSK表达的荧光定量分析
以大叶落地生根actin作为内参基因，根据KdSK的序列信息设计荧光定量的上游引物F1：5′TACAAAAACCGAGAGCTACAGA3′，下游引物R1：5′CAAAGGAATTCGTTGATGGA3′。以大叶落地生根中的根、茎、叶、叶柄为总RNA材料分析KdSK基因在不同组织中的表达情况。对大叶落地生根幼苗进行渗透胁迫处理（300 mmol·L1甘露醇），分别在处理的0、3、6、9、12、24 h采集叶位相同的叶片，每个处理设3个重复，3个重复混合取样，提取总RNA分析KdSK基因在渗透胁迫下的表达情况。按照Ist Strand cDNA Synthesis Kit （Takara）试剂盒操作说明合成cDNA，根据SYBR FAST qPCR Kit Master Mix （2×） Universal （KAPA Biosystems）试剂盒进行PCR扩增。荧光定量反应体系为SYBR FAST qPCR Kit Master Mix（2×） Universal 5 μL，上下游引物（10 μmol·L1） 各0.2 μL，cDNA 1 μL，ROX校正染料 0.2 μL，dH2O 3.4 μL，共10 μL。反应在ABI7900HT实时定量PCR仪上进行，反应条件为95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s。采用2-ΔΔCT法分析结果。
2结果与分析
2.1 KdSK cDNA克隆与测序
以大叶落地生根叶片第一链cDNA为模板，并用引物F1和R1进行PCR扩增，获得约1 000 bp的目的片段（图1：A）。根据获得的SK基因cDNA片段序列分别设计3′RACE和5′ RACE特异引物，获得约1 200 bp和500 bp的目的片段（图1：B， 图1：C）。将获得的cDNA片段的5′端和3′端序列进行拼接，以大叶落地生根叶片第一链cDNA为模板，设计验证引物，获得约1 800 bp的目的片段（图1：D）。因此，大叶落地生根SK基因的cDNA全长为1 712 bp （GenBank登录号：KU740358），命名为KdSK，含有1 272 bp完整开放阅读框（ORF），编码 423个氨基酸（图2），不包括PolyA尾的长度为1 700 bp，5′UTR（非编码区）238 bp，3′UTR 190 bp。 2.2 KdSK序列分析及系统进化树的构建
KdSK与黄瓜（XP_004147888.1）、胡杨（XP_011028359.1）、木本棉（KHF99017.1）、荷花（XP_010245513.1）、菠菜（KNA20150.1）的相似性分别为90%、89%、88%、87%、86%。通过ScanProsite在线软件分析，发现该蛋白具有明显的蛋白激酶的结构域（82～366），其中包括蛋白激酶ATP结构域（88～112）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化结构域（203～215）。
通过SIB中的Motif Scan，预测得到一些不同的基序，包括2个Nglycosylation site （239～242、313～316）、7个Casein kinase II phosphorylation site （23～26、49～52、144～147、262～265、287～290、303～306、356～359）、5个MYRISTYL Nmyristoylation site （7～12、20～25、58～63、70～75、270～275）、5个Protein kinase C phosphorylation site （3～5、11～13、146～148、229～231、373～375）、1个Tyrosine kinase phosphorylation site（112～119）、1个Protein tyrosine kinase（82～141）。
SK序列进行了氨基酸序列比对。从图3可以看出，不同植物SK氨基酸序列在几个重要功能位点的序列保守性程序很高，如蛋白激酶ATP结合区域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点。为了明确大叶落地生根KdSK与其他植物中蛋白激酶的进化关系，选取了6种植物中的26条SK蛋白序列进行分析。
利用Mega 6.0中的相邻连接法构建系统进化树（图4），采用默认参数，自检举1 000次，对生成的系统树进行Bootstrap校正。结果表明，这26条SK蛋白分为2个大枝，其中KdSK属于第一大枝，隶属于第二分枝。与拟南芥（AtSK31、AtSK32）、烟草（NSK111、NSK6、NSK91）、矮牵牛（PSK6、SPSK6、PSK7、PSK4）、小立碗藓（PpSK5、PpSK1、PpSK2）的亲缘关系都较远，而与苜蓿（MSK4）蛋白在进化关系最近，并且与拟南芥（AtSK41、AtSK42）属于同一大枝。由此推测，KdSK可能参与到渗透胁迫途径。
2.3 KdSK的理化性质及三级结构预测
KdSK蛋白的理论分子量为47.79 kD，理论等电点为8.37。脂溶指数为85.04，总平均亲水性（GRAVY）为-0.303，不稳定系数为34.09，表明该蛋白是一个稳定的蛋白。二级结构预测结果（图5）表明，KdSK含有30.97%的α螺旋，21.75%的β折叠和47.28%的随机卷曲，没有信号肽及其剪切位点，是水溶性的非分泌型蛋白，有3个明显的跨膜区（表1），被定位于细胞核中（预测精度为83%）。
通过Phyre在线预测网站预测的三维结构表明，KdSK蛋白分为2个部分，其中一个部分主要由α螺旋构成，另外两个部分由α螺旋和β折叠共同构成。一共有10个α螺旋和8个β折叠（图6：A）。KdSK蛋白中的259个氨基酸（占总氨基酸序列的61%），完全比对到G蛋白偶联受体激酶（GRK5）的A链上（图6：B）。
2.4 KdSK的组织表达分析
利用荧光实时定量PCR对KdSK在大叶落地生根中的表达情况进行检测，结果如图7所示，KdSK在根中表达量最高。表达量由高到低依次为根>茎>叶>叶柄。这些结果表明，KdSK在各组织中均有表达，但不具有组织特异性，主要在大叶落地生根的根部行使功能。
2.5 KdSK的誘导表达分析
用300 mmol·L1甘露醇对大叶落地生根进行渗透胁迫，以实时荧光定量PCR法分析其表达动态。图8结果显示，KdSK在甘露醇处理下存在先下降后上升再次下降而后上升的表达趋势。在处理 6 h时，KdSK的表达量达到最大值。随着处理时间的增加，KdSK的表达量出现剧烈变化之后，随后趋于平衡的状态。
3讨论
大叶落地生根类糖原合成激酶KdSK基因，通过NCBIBLAST的同源性比对，发现其氨基酸序列与黄瓜（XP_004147888.1）的相似性最高，该黄瓜序列是AtSK41的同源序列。利用相邻连接法构建进化树，可分为2大亚枝，KdSK蛋白属于第1大亚枝的第二分枝，与MSK4、AtSK41、AtSK42共同构成该分枝。这些结果都说明KdSK属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ类。KdSK蛋白与来自拟南芥、小立碗藓、苜蓿、小麦、烟草、矮牵牛中的同源蛋白进行多序列比对，发现该蛋白激酶的催化区序列非常保守，但是N端和C端的序列差异很大，同源性较低，表明不同的SKs可能通过不同的末端序列调节不同的生物过程。
KdSK蛋白有一个较小的N端区域和一个较大的C端区域，N端区域由1个α螺旋和6个反平行的β折叠构成，C端区域主要由α螺旋构成（孙浩等，2009）。ATP（三磷酸腺苷）结合口袋位于N端区域和C端区域的结合部，保守的Tyr残基是该蛋白的关键位点，在拟南芥中研究表明，该残基参与了拟南芥GSKs的磷酸化过程（DE LA Fuente Van Bentem et al， 2008）。在KdSK氨基酸序列中有一个丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性位点（位置为203～215），表明KdSK蛋白是一个丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。GSK3Shaggy激酶是盘基网柄菌建立极性必须的（Harwood et al， 1995），同样在维持非洲爪蟾胚胎的对称性中发挥重要作用（He et al， 1995）。果蝇中胚胎边界（Siegfried et al， 1992）和神经系统（Ruel et al， 1993）的空间结构也需要GSK3Shaggy激酶的参与。这说明KdSK蛋白很有可能参与到大叶落地生根胎生苗发育过程中的胚胎发生过程。 在不同組织中KdSK的表达量不同，暗示着KdSK可能参与了植物器官发育的调控，其中，在根中表达量最高，这也暗示着它主要在根中行使功能。在胁迫（甘露醇）处理下，KdSK基因在3h出现一个短暂的下降，随后在6 h表达量达到最高，随着时间的延长，表达量逐渐下降。Charrier（2002）等的研究表明，拟南芥Shaggylike家族中，AtSK42基因能够被高盐和渗透胁迫诱导，AtSK42基因表达量上调2倍以上，而在黑暗条件下，AtSK42基因表达下调4倍。KdSK基因属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ类，在渗透胁迫（甘露醇处理）下，表达量大量升高，暗示着KdSK基因极有可能参与大叶落地生根抗逆胁迫反应中。本研究对大叶落地生根类糖原合成激酶进行克隆和生物信息学分析，定量分析结果表明，KdSK基因可能参与到渗透胁迫的响应中，关于KdSK是否在大叶落地生根中参与胚胎建成、抗逆胁迫响应途径还需要进一步的实验进行验证。
参考文献：
BOUROUIS M， MOORE P， RUEL L， et al， 1990. An early embryonic product of the gene shaggy encodes a serine/threonine protein kinase related to the CDC28/cdc2+ subfamily [J]. Emb J， 9（9）：2877-2884.
CHARRIER B， 2002. Expression profiling of the whole Arabidopsis shaggylike kinase multigene family by realtime reverse transcriptasepolymerase chain reaction [J]. Plant Physiol， 130（2）：577-590.
CLAISSE G， CHARRIER B， KREIS M， 2007. The Arabidopsis thaliana GSK3/Shaggy like kinase AtSK32 modulates floral cell expansion [J]. Plant Mol Biol， 64（1-2）：113-124.
COMBET C， BLANCHET C， GEOURJON C， et al， 2000. NPS@： network protein sequence analysis [J]. Trends Biochem Sci， 25（3）：147-150.
DE LA FUENTE VAN BENTEM S， ANRATHER D， DOHNAL I， et al， 2008. Sitespecific phosphorylation profiling of Arabidopsis proteins by mass spectrometry and peptide chip analysis.[J]. J Prot Res， 7（6）：2458-2470.
DORNELAS MC， Van LAMMEREN AA， KREIS M， 2000. Arabidopsis thaliana SHAGGYrelated protein kinases （AtSK11 and 12） function in perianth and gynoecium development [J]. Plant J， 21（5）：419-429.
GASTEIGER E， HOOGLAND C， GATTIKER A， et al， 2005. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server [M]//WALKER JM. The Proteomics Protocols Handbook. Totowa， NJ： Humana Press： 571-607.
HARWOOD AJ， PLYTE SE， WOODGETT J， et al， 1995. Glycogen synthase kinase 3 regulates cell fate in dictyostelium [J]. Cell， 80（1）：139-148.
HE JX， GENDRON JM， YANG Y， et al， 2002. The GSK3like kinase BIN2 phosphorylates and destabilizes BZR1， a positive regulator of the brassinosteroid signaling pathway in Arabidopsis [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 99（15）：10185-10190.
HE X， SAINTJEANNET JP， WOODGETT JR， et al， 1995. Glycogen synthase kinase3 and dorsoventral patterning in Xenopus embryos [J]. Nature， 374（6523）：617-622.
KELLEY LA， STERNBERG MJE， 2009. Protein structure prediction on the Web： a case study using the Phyre server [J]. Nat Protoc， 4（3）：363-371.
KEMPA S， ROZHON W， AMAJ J， et al， 2007. A plastidlocalized glycogen synthase kinase 3 modulates stress tolerance and carbohydrate metabolism [J]. Plant J， 49（6）：1076-1090. LARKIN MA， BLACKSHIELDS G， BROWN NP， et al， 2007. Clustal W and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics， 23（21）：2947-2948.
MILLSLUJAN K， ANDREWS DL， CHOU C， et al， 2015. The roles of phosphorylation and SHAGGYLike protein kinases in geminivirus C4 protein induced hyperplasia [J]. PLoS ONE， 10（3）：e122 356.
NUSSE R， 1999. WNT targets. Repression and activation [J]. Trends Genet， 15（1）：1-3.
PIAO HL， LIM JH， KIM SJ， et al， 2001. Constitutive overexpression of AtGSK1 induces NaCl stress responses in the absence of NaCl stress and results in enhanced NaCl tolerance in Arabidopsis [J]. Plant J， 27（4）：305-314.
QI X， CHANDERBALI AS， WONG GK， et al， 2013. Phylogeny and evolutionary history of glycogen synthase kinase 3/SHAGGYlike kinase genes in land plants [J]. Bmc Evol Biol， 13：143.
RENSING SA， 2016. （Why） Does evolution favour embryogenesis？ [J]. Trends Plant Sci， 21（7）：562-573.
RICHARD O， PAQUET N， HAUDECOEUR E， et al， 2005. Organization and expression of the GSK3/Shaggy kinase gene family in the moss physcomitrella patens suggest early gene multiplication in land plants and an ancestral response to osmotic stress [J]. J Mol Evol， 61（1）：99-113.
RUEL L， BOUROUIS M， HEITZLER P， et al， 1993. Drosophila shaggy kinase and rat glycogen synthase kinase3 have conserved activities and act downstream of Notch [J]. Nature， 362（6420）：557-560.
SUN H， JIANG J， YU QS， et al， 2009. Molecular dynamics simulation of significant roles of structural water molecules in glycogen synthase kinase3β [J]. Acta Physicochimica Sin，25（4）：635-639. [孫浩， 蒋勇军， 俞庆森，等， 2009. 分子动力学模拟方法研究结构水在糖原合成酶激酶-3β中的作用[J]. 物理化学学报， 25（4）：635-639.]
SIEGFRIED E， CHOU TB， PERRIMON N， 1992. Wingless signaling acts through zestewhite 3， the drosophila homolog of glycogen synthase kinase3， to regulate engrailed and establish cell fate [J]. Cell， 71（7）：1167-1179.
SIEGFRIED E， PERKINS LA， CAPACI TM， et al， 1990. Putative protein kinase product of the drosophila segmentpolarity gene zestewhite3 [J]. Nature， 345（6278）：825-829.
SKAER H， 1998. Who pulls the string to pattern cell division in drosophila？ [J]. Trends Genet， 14（9）：337-339.
TAMURA K， DUDLEY J， NEI M， et al， 2007. MEGA4： molecular evolutionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0 [J]. Mol Biol Evol， 24（8）：1596-1599.
TICHTINSKYG， TAVARES R， TAKVORIAN A， et al， 1998. An evolutionary conserved group of plant GSK3/shaggylike protein kinase genes preferentially expressed in developing pollen [J]. Biochim Biophys Acta， 1442（2-3）：261-273.
YOO MJ， ALBERT VA， SOLTIS PS， et al， 2006. Phylogenetic diversification of glycogen synthase kinase 3/SHAGGYlike kinase genes in plants [J]. Bmc Plant Biol， 6：3.
ZHONG T， ZHU C， ZENG H， et al， 2013. Analysis of gene expression in Kalanchoe daigremontiana leaves during plantlet formation under drought stress [J]. Electron J Biotechnol， 16： 4.