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摘要：在对唑草酮进行残留分析试验的过程中，对其浓度的分析检测方法有很多。通过HPLC和 LC-MS对唑草酮原药的检测比较，得到HPLC对唑草酮的LOD为0.011 mg/L，LOQ为0.036 mg/L；LC-MS对唑草酮的LOD为0.036 ng/L，LOQ为2.04 ng/L，且HPLC和LC-MS对唑草酮原药的检测方法都具有易操作、分离特性好的特点，但LC-MS的检出限比HPLC低，推荐LC-MS适合用来分析唑草酮含量较低的样品，而HPLC适合用来分析唑草酮含量较高的样品。
关键词：唑草酮；HPLC；LC-MS
中图分类号：O657文献标志码：A文章编号：1003-935X（2016）04-0048-08[KH+7mmD]
Comparison of Detection Methods of Carfentrazone [JZ]Ethyl by HPLC and LC-MS
[KH+7mmD][WT5BZ][JZ（]NIE Tianying，CHEN Hongshen，LIN Shaoxia，YANG Hongbo
[WT5”BZ]（1.Guizhou Academy of Testing and Analysis，Guiyang 550002，China；2. College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）
[JZ）][KH+7mmD][WT5”HZ]Abstract：
[WT5”BZ]There are many methods for determining the carfentrazone-ethyl concentration as part of residue analyses. The detection of carfentrazone-ethyl by HPLC and LC-MS was compared. The LOD and LOQ by HPLC were 0.011 mg/L and 0.036 mg/L，respectively. The LOD and LOQ by LC-MS were 0.036 ng/L and 2.04 ng/L，respectively. Both the HPLC and LC-MS detection methods for carfentrazone-ethyl are easy to operate. The characteristics of separation properties are good but the detection limit of LC-MS is lower than that of HPLC. LC-MS is suitable for the analysis of samples containing low concentrations of carfentrazone-ethyl and HPLC for those having high content samples of the herbicide.
唑酮草酯属原卟啉原氧化酶抑制剂，即通过抑制叶绿素生物合成过程中原卟啉原氧化酶而引起细胞膜破坏，使叶片迅速干枯、死亡，适用于小麦、大麦、燕麦、水稻、玉米、大豆、柑橘、咖啡、棉花、高粱、葡萄園、草坪等田块除草[1]。
目前有关唑草酮在水稻、小麦及甘蔗中的残留分析方法相继出现[2-11]。提取的唑草酮经过了石油醚萃取，弗罗里硅土柱净化后，乙酸乙酯洗脱，正己烷定容后采用气相色谱检测[3]。建立的分析方法虽能满足试验需要，但在实际操作过程中较为繁琐，且在分析唑草酮含量较低样品时检出限有时候往往达不到。
本试验通过对高效液相色谱仪（Agilent HPLC 1220）和液相色谱质谱连用仪（Agilent 1260-6410B，具有ESI离子源；Masshunter色谱数据处理机或色谱工作站）所建立的唑草酮分析方法的比较，丰富和优化了唑草酮分析方法，以期为后续开展唑草酮检测分析试验提供参考。
1用HPLC建立的唑草酮检测分析方法
1.1试验方法
1.1.1方法提要试样用水溶解，以乙腈+水（含0.1%磷酸）为流动相，用Agilent Extend-C18柱和VWD检测器，用外标法定量。
1.1.2试剂和溶液乙腈（色谱纯，Merck KGaA，批号：JA028530）；磷酸（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司，批号：20130908）；超纯水（电阻率：18.25 MΩ/cm）；盐酸（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：20150311）；唑草酮标准品（已知质量分数，ω≥99.5%，Dr. Ehrenstorfer Gmbh，批号：21211）。
1.1.3仪器高效液相色谱仪：Agilent HPLC 1220；色谱数据处理机或色谱工作站；微量进样器：100 μL；pH计：FE20。
1.1.4液相色谱操作条件色谱柱：Agilent Extend-C18柱；250 mm×4.60 mm（i.d.），5 μm；进样体积：20 μL；流速：0.8 mL/min；流动相：01%磷酸水溶液-乙腈，体积比12 ∶[KG-*3]88；柱温：30 ℃；检测波长：245 nm；运行时间：7 min。
1.1.5方法选择性用上述分析方法测定95%唑草酮原药，试验结果唑草酮保留时间为 3.940 min，唑草酮与杂质峰间的分离度为8.53，大于1.5，方法对测定试验溶液中唑草酮具有特定选择性（图1）。
1.1.6测定在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标准曲线中间点的标样溶液，直至相邻两针唑草酮峰面积的相对变化小于1.2%后，进行测定。 1.2方法验证
1.2.1线性相关性试验称取唑草酮标样 0.010 03 g 置于25 mL容量瓶中，用乙腈并稀释至刻度，得到浓度为400 mg/L的唑草酮标准储备液。将标准储备液用乙腈稀释，得到浓度为 10 mg/L 的唑草酮标准溶液。用上述浓度为 10 mg/L 的唑草酮标准溶液，用乙腈稀释，得到唑草酮浓度为0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/L的系列标样溶液。按“1.1.4”节的色谱操作条件进行分析，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到唑草酮线性方程为y=3397x+1.07，其线性相关系数为0.999 8，线性相关性的测定结果见表1和图2、图3。
1.2.2重复性试验取“1.2.1”节配制的浓度为0.2 mg/L的唑草酮标准溶液，按“1.1.4”节的色谱操作条件进行精密度试验测试，结果见表2和图4。
1.2.3检出限和定量限取“1.2.1”节配制的浓度为0.1 mg/L的唑草酮标准溶液，按“1.1.4”节的色谱操作条件重复测定6次，S/N≈3和S/N≈10时溶液浓度为该方法的检出限和定量限。试验结果表明，所建立的方法对唑草酮LOD为 0.011 mg/L，LOQ为0.036 mg/L。详细结果见表3。
2.1试验方法
2.1.1方法提要试样用水溶解，使用Agilent 1260-6410B LC/MS/MS测定，以水（含0.1%甲酸）溶液+乙腈为流动相，Agilent XDB-C18柱和MSD检测器，对试样中的唑草酮进行测定，外标法定量。
2.1.2试剂和溶液乙腈：色谱纯（Merck KGaA，批号：JA028530）；甲酸：色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20150424）；超纯水：电阻率，18.25 MΩ/cm；唑草酮标样：已知质量分数，ω=99.5%，批号：21211。
2.1.3仪器液相色谱质谱连用仪：Agilent 1260-6410B，具有ESI离子源；Masshunter色谱数据处理机或色谱工作站；色谱柱：Agilent XDB-C18柱；50 mm×4.60 mm（i.d.），1.8 μm；微量进样器：100 μL。
2.1.4仪器操作条件
2.1.4.1HPLC操作条件进样体积：20 μL；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；流动相：25%水（含0.1%甲酸）溶液+75%乙腈（体积比）；保留时间：唑草酮3.32 min。
2.1.4.2MSD操作条件离子源：ESI源，正离
子模式；离子源参数：干燥气体，N2；气体温度，300 ℃；气体流速，8 L/min；Nebulizer，40 psi；Capillary，4 000 V；监测模式：MRM；监测离子参数见表4、图7。2.1.5方法选择性建立上述分析方法测定95%唑草酮原药，试验结果表明，试样中唑草酮保留时间为3.32 min，目标峰可实现基线分离，不存在其他杂质干扰现象。
2.1.6测定在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标准曲线中间点的标样溶液，直至相邻两针唑草酮标样峰面积的相对变化小于2%后，进行测定。
2.2方法验证
2.2.1线性相关性试验称取唑草酮标样（ω=99.5%）0.010 03 g，置于25.00 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得到浓度为400 mg/L的唑草酮标准储备液。将标准储备液用乙腈稀释，得到浓度为10 mg/L的唑草酮标准溶液。将上述浓度为10 mg/L的唑草酮标准溶液用乙腈稀释，吸取适当该储备液配制成梯度系列标准溶液，按“2.1.4”节仪器操作条件进行分析，以唑草酮浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到唑草酮线性方程为y=14.79x+18.55，其线性相关系数为0.999 8，线性相关性的测定结果见表5和图7、图8。
2.2.2重复性试验取“2.2.1”节配制的浓度为50 ng/mL的唑草酮标准溶液，按“2.1.4”节仪器操作条件连续测试6次，计算相对标准偏差，验证方法的精密度，结果见表6和图9。
2.2.3检出限和定量限取“2.2.1”节配制的浓度为50 ng/mL的唑草酮标准溶液，按“2.1.4”节
色谱操作条件重复测定6次，根据S/N值计算出LOD和LOQ值，试验结果表明，所建立的方法对唑草酮LOD为0.63 ng/mL，LOQ为2.04 ng/mL（表7、图10）。
3结论[JP]
本试验用Agilent HPLC 1220和Agilent 1260-6410B建立了唑草酮原药的2种分析方法，2种方法相比较有以下特点：（1）用HPLC建立的分析方[JP+1]法测定95%唑草酮原药，保留时间为 3.940 min，唑草酮与杂质峰间的分离度为8.53，大于1.5，线性方程为y=33.97x+1.07，其线性相关系数为0999 8；用LC-MS建立的分析方法测定95%唑草酮原药，保留时间为3.32 min，目标峰可实现基线分离，不存在其他杂质干扰现象。且相邻两针唑草酮标样峰面积的相对变化小于2%，线性方程为y=14.79x+18.55，其线性相关系数为 0.999 8，且2种分析方法操作起来都较简单。（2）2种分析方法相对比而言，用 LC-MS建立的分析方法检出限（0.036 ng/L）要比HPLC建立的分析方法檢出限（0.011 mg/L）低106个数量级，
且 LC-MS的定量限（2.04 ng/L）也比HPLC的定量限（0.036 mg/）低106个数量级。
在具体试验过程中，遇到唑草酮含量较低的样品，推荐用本试验建立的LC-MS分析方法来分析低浓度（ng/L）的唑草酮样品。 [HS+7mm][HT8.5H]参考文献：
[1]胡耐冬，刘长令. 新型三唑啉酮类除草剂唑酮草酯[J]. 精细与专用化学品，2003，11（14）：21-24.
[2]张志勇，王冬兰，吴长付，等. 唑草酮在水稻和稻田中的气相色谱检测[J]. 江苏农業学报，2011，27（1）：195-198.[HT][HJ]
[3]张夏力，刘新刚，路彩红，等. 气相色谱-串联质谱方法测定小麦中唑草酮的残留及消解动态[J]. 植物保护，2012，38（1）：115-119.
[4]杨玉霞，莫仁甫，王天顺，等. 毛细管气相色谱法测定唑草酮在甘蔗及其土壤中的残留量[J]. 西南农业学报，2011，24（6）：2230-2233.
[5]胡西洲，程运斌，胡定金. 农药多残留分析中QuEchERS方法介绍[J]. 现代农药，2006，5（4）：24-29，44.
[6]曹新梅，仲苏林，吴建兰，等. 唑草酮20%微囊悬浮剂高效液相色谱分析方法[J]. 农药科学与管理，2010，31（5）：38-40.
[7]吴进龙，张志一，单炜力，等. 唑草酮原药高效液相色谱分析方法研究[J]. 农药科学与管理，2008，29（2）：9-12.
[8]USP official. USP proposes revision of general chapter <1225> Validation of compendial procedures：Adding a section on Life Cycle Management[S/OL]. 2007-12-01. [2016-08-20]. http：//[JP2]www.gmp-compliance.org/gmp-news/usp-proposes-revision-[JP+1]of-general-chapter-1225-validation-of-compendial-procedures-adding-a-section-on-life-cycle-management.
[9]CIPAC No.3807：2003：Guidelines on method validation to be performed in support of analytical methods for agrochemical formulations[S/OL]. 2003-06-28.
关键词：唑草酮；HPLC；LC-MS
中图分类号：O657文献标志码：A文章编号：1003-935X（2016）04-0048-08[KH+7mmD]
Comparison of Detection Methods of Carfentrazone [JZ]Ethyl by HPLC and LC-MS
[KH+7mmD][WT5BZ][JZ（]NIE Tianying，CHEN Hongshen，LIN Shaoxia，YANG Hongbo
[WT5”BZ]（1.Guizhou Academy of Testing and Analysis，Guiyang 550002，China；2. College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）
[JZ）][KH+7mmD][WT5”HZ]Abstract：
[WT5”BZ]There are many methods for determining the carfentrazone-ethyl concentration as part of residue analyses. The detection of carfentrazone-ethyl by HPLC and LC-MS was compared. The LOD and LOQ by HPLC were 0.011 mg/L and 0.036 mg/L，respectively. The LOD and LOQ by LC-MS were 0.036 ng/L and 2.04 ng/L，respectively. Both the HPLC and LC-MS detection methods for carfentrazone-ethyl are easy to operate. The characteristics of separation properties are good but the detection limit of LC-MS is lower than that of HPLC. LC-MS is suitable for the analysis of samples containing low concentrations of carfentrazone-ethyl and HPLC for those having high content samples of the herbicide.
唑酮草酯属原卟啉原氧化酶抑制剂，即通过抑制叶绿素生物合成过程中原卟啉原氧化酶而引起细胞膜破坏，使叶片迅速干枯、死亡，适用于小麦、大麦、燕麦、水稻、玉米、大豆、柑橘、咖啡、棉花、高粱、葡萄園、草坪等田块除草[1]。
目前有关唑草酮在水稻、小麦及甘蔗中的残留分析方法相继出现[2-11]。提取的唑草酮经过了石油醚萃取，弗罗里硅土柱净化后，乙酸乙酯洗脱，正己烷定容后采用气相色谱检测[3]。建立的分析方法虽能满足试验需要，但在实际操作过程中较为繁琐，且在分析唑草酮含量较低样品时检出限有时候往往达不到。
本试验通过对高效液相色谱仪（Agilent HPLC 1220）和液相色谱质谱连用仪（Agilent 1260-6410B，具有ESI离子源；Masshunter色谱数据处理机或色谱工作站）所建立的唑草酮分析方法的比较，丰富和优化了唑草酮分析方法，以期为后续开展唑草酮检测分析试验提供参考。
1用HPLC建立的唑草酮检测分析方法
1.1试验方法
1.1.1方法提要试样用水溶解，以乙腈+水（含0.1%磷酸）为流动相，用Agilent Extend-C18柱和VWD检测器，用外标法定量。
1.1.2试剂和溶液乙腈（色谱纯，Merck KGaA，批号：JA028530）；磷酸（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司，批号：20130908）；超纯水（电阻率：18.25 MΩ/cm）；盐酸（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：20150311）；唑草酮标准品（已知质量分数，ω≥99.5%，Dr. Ehrenstorfer Gmbh，批号：21211）。
1.1.3仪器高效液相色谱仪：Agilent HPLC 1220；色谱数据处理机或色谱工作站；微量进样器：100 μL；pH计：FE20。
1.1.4液相色谱操作条件色谱柱：Agilent Extend-C18柱；250 mm×4.60 mm（i.d.），5 μm；进样体积：20 μL；流速：0.8 mL/min；流动相：01%磷酸水溶液-乙腈，体积比12 ∶[KG-*3]88；柱温：30 ℃；检测波长：245 nm；运行时间：7 min。
1.1.5方法选择性用上述分析方法测定95%唑草酮原药，试验结果唑草酮保留时间为 3.940 min，唑草酮与杂质峰间的分离度为8.53，大于1.5，方法对测定试验溶液中唑草酮具有特定选择性（图1）。
1.1.6测定在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标准曲线中间点的标样溶液，直至相邻两针唑草酮峰面积的相对变化小于1.2%后，进行测定。 1.2方法验证
1.2.1线性相关性试验称取唑草酮标样 0.010 03 g 置于25 mL容量瓶中，用乙腈并稀释至刻度，得到浓度为400 mg/L的唑草酮标准储备液。将标准储备液用乙腈稀释，得到浓度为 10 mg/L 的唑草酮标准溶液。用上述浓度为 10 mg/L 的唑草酮标准溶液，用乙腈稀释，得到唑草酮浓度为0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/L的系列标样溶液。按“1.1.4”节的色谱操作条件进行分析，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到唑草酮线性方程为y=3397x+1.07，其线性相关系数为0.999 8，线性相关性的测定结果见表1和图2、图3。
1.2.2重复性试验取“1.2.1”节配制的浓度为0.2 mg/L的唑草酮标准溶液，按“1.1.4”节的色谱操作条件进行精密度试验测试，结果见表2和图4。
1.2.3检出限和定量限取“1.2.1”节配制的浓度为0.1 mg/L的唑草酮标准溶液，按“1.1.4”节的色谱操作条件重复测定6次，S/N≈3和S/N≈10时溶液浓度为该方法的检出限和定量限。试验结果表明，所建立的方法对唑草酮LOD为 0.011 mg/L，LOQ为0.036 mg/L。详细结果见表3。
2.1试验方法
2.1.1方法提要试样用水溶解，使用Agilent 1260-6410B LC/MS/MS测定，以水（含0.1%甲酸）溶液+乙腈为流动相，Agilent XDB-C18柱和MSD检测器，对试样中的唑草酮进行测定，外标法定量。
2.1.2试剂和溶液乙腈：色谱纯（Merck KGaA，批号：JA028530）；甲酸：色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20150424）；超纯水：电阻率，18.25 MΩ/cm；唑草酮标样：已知质量分数，ω=99.5%，批号：21211。
2.1.3仪器液相色谱质谱连用仪：Agilent 1260-6410B，具有ESI离子源；Masshunter色谱数据处理机或色谱工作站；色谱柱：Agilent XDB-C18柱；50 mm×4.60 mm（i.d.），1.8 μm；微量进样器：100 μL。
2.1.4仪器操作条件
2.1.4.1HPLC操作条件进样体积：20 μL；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；流动相：25%水（含0.1%甲酸）溶液+75%乙腈（体积比）；保留时间：唑草酮3.32 min。
2.1.4.2MSD操作条件离子源：ESI源，正离
子模式；离子源参数：干燥气体，N2；气体温度，300 ℃；气体流速，8 L/min；Nebulizer，40 psi；Capillary，4 000 V；监测模式：MRM；监测离子参数见表4、图7。2.1.5方法选择性建立上述分析方法测定95%唑草酮原药，试验结果表明，试样中唑草酮保留时间为3.32 min，目标峰可实现基线分离，不存在其他杂质干扰现象。
2.1.6测定在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标准曲线中间点的标样溶液，直至相邻两针唑草酮标样峰面积的相对变化小于2%后，进行测定。
2.2方法验证
2.2.1线性相关性试验称取唑草酮标样（ω=99.5%）0.010 03 g，置于25.00 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，得到浓度为400 mg/L的唑草酮标准储备液。将标准储备液用乙腈稀释，得到浓度为10 mg/L的唑草酮标准溶液。将上述浓度为10 mg/L的唑草酮标准溶液用乙腈稀释，吸取适当该储备液配制成梯度系列标准溶液，按“2.1.4”节仪器操作条件进行分析，以唑草酮浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到唑草酮线性方程为y=14.79x+18.55，其线性相关系数为0.999 8，线性相关性的测定结果见表5和图7、图8。
2.2.2重复性试验取“2.2.1”节配制的浓度为50 ng/mL的唑草酮标准溶液，按“2.1.4”节仪器操作条件连续测试6次，计算相对标准偏差，验证方法的精密度，结果见表6和图9。
2.2.3检出限和定量限取“2.2.1”节配制的浓度为50 ng/mL的唑草酮标准溶液，按“2.1.4”节
色谱操作条件重复测定6次，根据S/N值计算出LOD和LOQ值，试验结果表明，所建立的方法对唑草酮LOD为0.63 ng/mL，LOQ为2.04 ng/mL（表7、图10）。
3结论[JP]
本试验用Agilent HPLC 1220和Agilent 1260-6410B建立了唑草酮原药的2种分析方法，2种方法相比较有以下特点：（1）用HPLC建立的分析方[JP+1]法测定95%唑草酮原药，保留时间为 3.940 min，唑草酮与杂质峰间的分离度为8.53，大于1.5，线性方程为y=33.97x+1.07，其线性相关系数为0999 8；用LC-MS建立的分析方法测定95%唑草酮原药，保留时间为3.32 min，目标峰可实现基线分离，不存在其他杂质干扰现象。且相邻两针唑草酮标样峰面积的相对变化小于2%，线性方程为y=14.79x+18.55，其线性相关系数为 0.999 8，且2种分析方法操作起来都较简单。（2）2种分析方法相对比而言，用 LC-MS建立的分析方法检出限（0.036 ng/L）要比HPLC建立的分析方法檢出限（0.011 mg/L）低106个数量级，
且 LC-MS的定量限（2.04 ng/L）也比HPLC的定量限（0.036 mg/）低106个数量级。
在具体试验过程中，遇到唑草酮含量较低的样品，推荐用本试验建立的LC-MS分析方法来分析低浓度（ng/L）的唑草酮样品。 [HS+7mm][HT8.5H]参考文献：
[1]胡耐冬，刘长令. 新型三唑啉酮类除草剂唑酮草酯[J]. 精细与专用化学品，2003，11（14）：21-24.
[2]张志勇，王冬兰，吴长付，等. 唑草酮在水稻和稻田中的气相色谱检测[J]. 江苏农業学报，2011，27（1）：195-198.[HT][HJ]
[3]张夏力，刘新刚，路彩红，等. 气相色谱-串联质谱方法测定小麦中唑草酮的残留及消解动态[J]. 植物保护，2012，38（1）：115-119.
[4]杨玉霞，莫仁甫，王天顺，等. 毛细管气相色谱法测定唑草酮在甘蔗及其土壤中的残留量[J]. 西南农业学报，2011，24（6）：2230-2233.
[5]胡西洲，程运斌，胡定金. 农药多残留分析中QuEchERS方法介绍[J]. 现代农药，2006，5（4）：24-29，44.
[6]曹新梅，仲苏林，吴建兰，等. 唑草酮20%微囊悬浮剂高效液相色谱分析方法[J]. 农药科学与管理，2010，31（5）：38-40.
[7]吴进龙，张志一，单炜力，等. 唑草酮原药高效液相色谱分析方法研究[J]. 农药科学与管理，2008，29（2）：9-12.
[8]USP official. USP proposes revision of general chapter <1225> Validation of compendial procedures：Adding a section on Life Cycle Management[S/OL]. 2007-12-01. [2016-08-20]. http：//[JP2]www.gmp-compliance.org/gmp-news/usp-proposes-revision-[JP+1]of-general-chapter-1225-validation-of-compendial-procedures-adding-a-section-on-life-cycle-management.
[9]CIPAC No.3807：2003：Guidelines on method validation to be performed in support of analytical methods for agrochemical formulations[S/OL]. 2003-06-28.