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【摘要】 本文简要介绍高效液相色谱技术的历史发展，对几种常见的高效液相色谱进行了介绍，评述了高效液相色谱法（HPLC）在药物分析的应用。由于HPLC具有专属性强、灵敏度高等特点，因此在药物成分的分离与测定方面充分发挥了其优势。
【关键词】 高效液相色谱；药物分析中；应用
文章编号：1004-7484（2014）-06-3049-02
1 高效液相色谱（HPLC）概论
1.1 高效液相色谱的历史发展 高效液相色谱的发展始于20世纪60年代，由于其具有分离和分析的双重功能，且有很高的选择性和较高的灵敏度，因而可同时分析结构相似的药物和代谢物等。色谱法中以高效液相色谱法最为常用，因其克服了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点，成为一种高效、快速的分离技术。特别是反相高效液相色谱法（RP-HPLC）更具有试剂价廉、方法简单和适应范围广等优点，现已成为体内药物分析方法中最重要的方法，并常作为体内药物分析中评价其它方法的参比方法。
1.2 高效液相色谱的特点 ①高压；②高速；③高效；④高灵敏度；⑤适应范围宽。
1.3 高效液相色谱分类 高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类：①吸附色谱法，以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法；②液-液分配色谱法，液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K）的不同而被分离；③离子交换色谱法离子对交换色谱法是以离子交换剂为固定相的色谱方法，组分因和离子交换剂亲和力的不同而被分离；④空间排斥色谱法，空间排斥色谱也称为凝胶色谱。其固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质，即凝胶；⑤亲和色谱法，亲和色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从生物样品中分离和分析一些特殊物质的色谱方法；⑥手性色谱法，不少有机药物的结构中有不对称碳原子，又称手性碳原子，有手性碳原子的药物具有旋光性。立体构型不同的一对对映体，其药效、毒副作用往往不相同。
2 在药物分析中的应用
在药物分析中，高效液相色谱已成为各类药物及其制剂进行鉴别、检查、杂质分离及含量测定的重要手段。
2.1 在鉴别中的应用 在HPLC法中，由于保留时间与组分的结构和性质有关，不同的药物由于结构和性质的差异在谱图上出峰顺序不同，因而根据这定性的参数可用于药物的鉴别。如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。
2.2 在杂质检查中的应用 在HPLC分离检测中的保留时间不同，用HPLC对药物鉴别和杂质检查，具有较强的专属性，HPLC分離效能高，灵敏，在药物的杂质检查中应用广泛。药物中有关杂质主要是药物中存在的合成原料、中间体、副产物、降解产物等物质，这些物质的结构和性质与药物相似，含量很低，只有采用色谱的方法才能将其分离并检测。
2.3 在含量测定中的应用 色谱图面积与浓度呈线性关系是其可以定量测定的依据。高效液相色谱法专属性强、灵敏度高，在药物含量测定中的应用十分广泛。如中国药典中合成药及其制剂，用其测定含量可以消除药物中的杂质，制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰。中药材及其制剂组成复杂，其中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法。
2.3.1 常用药物分析中的应用 常用药物系指解热镇痛药、镇静药、心血管药等。HPLC能很好的分离这些药物中的各种有效成分。例如，中国药典记录的阿斯匹林、非那西丁、咖啡因的含量测定。
2.3.2 甾体药物分析中的应用 甾体药物主要是指甾醇的衍生物，其可分为肾上腺皮激素、雄性激素、雌性激素和孕激素。各类型的甾体药物都可以用HPLC成功的分离。例如炔诺孕酮用内标法测定含量。
2.3.3 抗菌素类药物分析中的应用 抗菌素种类繁多，临床应用广泛，依据化学结构的不同，可分为B_内酰胺类抗菌素、氨基糖苷类抗菌素、四环素类抗菌素、氟喹诺酮类抗菌素等。HPLC分析技术近年来在抗生素的质量控制中已广泛应用。对结构、组分等较清楚的药物，HPLC分析将逐步取代传统的生物测定。目前，各国药典中应用HPLC技术对抗生素进行质量控制的项目包括鉴别、组分分析、含量测定和相关物质测定等。如青霉素有效成分的分离可采用反相键合色谱法，硫酸庆大霉素C组分的含量测定。
2.3.4 手性药物分析中的应用 两种化学组成、分子式完全相同的化合物，但因组成化合物的原子在空间取向不同，而成为镜像的化合物，或称为手性化合物。由于对映体的物理、化学性质相同，实现它们的分离就比较困难，如大多数氨基酸都有右旋体和左旋体，但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物。对于手性药物往往呈现一种对映体具有强的生物活性和药效，而另一种却无效。手性药物HPLC法现已成为手性药物质量控制和新药研发中应用最为广泛的技术。如对酮康唑外消旋体采用C18键合固定相，以磺丁基-B-环糊精为手性流动相添加剂进行拆分而使酮康唑的右旋体和左旋体得以分离。
2.4 生物药物分析中的应用 生物药物是从动、植物、微生物中提取的、生物-化学半合成的或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物。包括生化药物和生物制品等。例如中国药典对重组人生长激素、重组人胰岛素、重组人粒细胞集落刺激因子的鉴别。
2.5 在血药浓度检测中的应用 药物在体内经过吸收、分布，可形成一定的血药浓度，利用高效液相色谱法可监测药物的血药浓度，保证用药安全。如对乙酰氨基酚急性中毒的血药浓度的检测：对乙酰氨基酚是临床上使用极其广泛的解热镇痛药，由于患者状态的多样性以及对酰氨基酚中毒的早期症状与胃溃疡症状极其相似且肝功正常，故常常发生漏诊，等到发生肝损伤已经错过了治疗最佳时机。因此，国外已将对乙酰氨其酚血浓度作为急诊中毒病人常规检测。色谱条件：采用Nova-PakC18柱（4μm，150mm×3.9mm），柱温25℃；流动相为甲醇-水（30：30），流速为0.8ml/min；二极管阵列检测器，检测波长254nm。血浆样品制备；取静脉血3ml-4ml，置含肝素抗凝剂的离心管中，离心分离5min（3000r/min），上清液为待测血浆。取上述血浆1ml，加饱和硫酸锌溶液1ml，沉淀蛋白后，加入乙醚5ml，涡漩混合1min，离心20min（3000r/min）。精密吸取乙醚液3.0ml于50℃氮气流吹干，冷至室温，以蒸馏水500μl溶解残渣，取10μl进样。对照品溶液制备；配制对乙酰氨基酚甲醇溶液（10mg/ml），并用甲醇逐级稀释成浓度为0.01mg/ml-5mg/ml的对照品溶液，4℃冰箱存放备用。血浆中对乙酰氨基酚标准曲线制备；取肝素抗凝的血浆1ml，分别加入不同浓度的对乙酰氨基酚工作液100μl，使血浆中药物浓度为0.9μg/ml-454.5μg/ml，再按“血浆样品制备”项下方法操作，记录色谱图，以溶液C对峰面积A作线性回归，得回归方程：A=1.64×104+1.68×107C，R=0.9995，线性范围为0.9μg/ml-454.5μg/ml，最低检测浓度为0.9μg/ml（以信噪比≥3计）。用HPLC测定可疑中毒病人血中对乙酰氨基酚浓度具有准确、快速的优点，可有效地帮助临床医生确诊，快速有效地救治患者，对提高医疗质量有重要意义。 2.6 天然药物分析中的应用 由于天然药物的化学成分复杂，对于控制药品质量，建立质量标准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行分离鉴定，再测定有效成分的含量；通过指纹图谱建立识别模式，可以判定药材的质量高低。
3 高效色谱法在药物分析的研究动向及应用进展
3.1 检测手段的进步 近年来，高效液相色谱教重要的发展方面是检测器的发展，如二极管阵列检测器和高效液相蒸发激光散射检测器，可以用高效液相二极管阵列检测器分离检测银杏等叶中黄酮成分，用高效液相蒸发激光散射检测器测定银杏叶提取物中内酯的含量等。仪器的进一步发展，HPLC在药物分析中会成为更加有效的高灵敏度的方法和可操作性。
3.2 二（多）维色谱 为了从复杂样品中分离或定量某一特定成分，可采用两种或两种以上的不同的色谱方法，即采用二维或多维色谱，多维色谱能够灵活应用传统HPLC，在复杂生物样品的分析中表现出一定的优势，有着广泛的应用前景。
3.3 色谱技术的联用 目前，对某一复杂样品的分析很难用单一分析分离方法解决，使用HPLC联用技术是发展趋势之一。如液相色谱—质谱技术联用可用于药物代谢研究、天然产物快速分析以及生物大分子分析
3.4 微液相色谱的研究 由于微液相色谱分析所需的样品量及流动相的消耗大大下降，检测灵敏度又大大提高，相信此法在药物分析中也能发挥它的优点。
4 结论和展望
综上所述，HPLC是現代分离测定的重要手段。由于它具有专属性强、简便快速、灵敏度高等特点，既可用于分离也可用于定量分析，适用于各种各样的有机化合物，因此目前在药物成分的分离与测定方面得到了广泛的应用。相信随着检测手段的进步、各种联用技术的出现以及其他一些相关问题的解决，HPLC在医药研究中将会发挥越来越重要的作用。
参考文献
[1] 中国药典委员会.中国药典（2010年版）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.
[2] 姚彤炜.药物分析[M].杭州：浙江大学出版社，2011.5.
[3] 刘文英.药物分析[M].（第6版）.北京：人民卫生出版社，2007.
[4] 王绪明，白林.高效液相色谱及其联用技术在药物分析中的应用新进展（二）[J].解放军药学学报，2004（06）.
[5] 张良晓.高效液相色谱在药物分析中的应用研究进展[J].内蒙古石油化工，2005（07）.
[6] 周南.液相色谱法及其相关技术的最新进展[J].上海化工，2001（01）.
[7] 黄永焯，王宁生.HPLC/ELSD在天然药物分析中的应用[J].中药新药与临床药理，2001（12）6：78.
【关键词】 高效液相色谱；药物分析中；应用
文章编号：1004-7484（2014）-06-3049-02
1 高效液相色谱（HPLC）概论
1.1 高效液相色谱的历史发展 高效液相色谱的发展始于20世纪60年代，由于其具有分离和分析的双重功能，且有很高的选择性和较高的灵敏度，因而可同时分析结构相似的药物和代谢物等。色谱法中以高效液相色谱法最为常用，因其克服了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点，成为一种高效、快速的分离技术。特别是反相高效液相色谱法（RP-HPLC）更具有试剂价廉、方法简单和适应范围广等优点，现已成为体内药物分析方法中最重要的方法，并常作为体内药物分析中评价其它方法的参比方法。
1.2 高效液相色谱的特点 ①高压；②高速；③高效；④高灵敏度；⑤适应范围宽。
1.3 高效液相色谱分类 高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类：①吸附色谱法，以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法；②液-液分配色谱法，液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K）的不同而被分离；③离子交换色谱法离子对交换色谱法是以离子交换剂为固定相的色谱方法，组分因和离子交换剂亲和力的不同而被分离；④空间排斥色谱法，空间排斥色谱也称为凝胶色谱。其固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质，即凝胶；⑤亲和色谱法，亲和色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从生物样品中分离和分析一些特殊物质的色谱方法；⑥手性色谱法，不少有机药物的结构中有不对称碳原子，又称手性碳原子，有手性碳原子的药物具有旋光性。立体构型不同的一对对映体，其药效、毒副作用往往不相同。
2 在药物分析中的应用
在药物分析中，高效液相色谱已成为各类药物及其制剂进行鉴别、检查、杂质分离及含量测定的重要手段。
2.1 在鉴别中的应用 在HPLC法中，由于保留时间与组分的结构和性质有关，不同的药物由于结构和性质的差异在谱图上出峰顺序不同，因而根据这定性的参数可用于药物的鉴别。如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。
2.2 在杂质检查中的应用 在HPLC分离检测中的保留时间不同，用HPLC对药物鉴别和杂质检查，具有较强的专属性，HPLC分離效能高，灵敏，在药物的杂质检查中应用广泛。药物中有关杂质主要是药物中存在的合成原料、中间体、副产物、降解产物等物质，这些物质的结构和性质与药物相似，含量很低，只有采用色谱的方法才能将其分离并检测。
2.3 在含量测定中的应用 色谱图面积与浓度呈线性关系是其可以定量测定的依据。高效液相色谱法专属性强、灵敏度高，在药物含量测定中的应用十分广泛。如中国药典中合成药及其制剂，用其测定含量可以消除药物中的杂质，制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰。中药材及其制剂组成复杂，其中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法。
2.3.1 常用药物分析中的应用 常用药物系指解热镇痛药、镇静药、心血管药等。HPLC能很好的分离这些药物中的各种有效成分。例如，中国药典记录的阿斯匹林、非那西丁、咖啡因的含量测定。
2.3.2 甾体药物分析中的应用 甾体药物主要是指甾醇的衍生物，其可分为肾上腺皮激素、雄性激素、雌性激素和孕激素。各类型的甾体药物都可以用HPLC成功的分离。例如炔诺孕酮用内标法测定含量。
2.3.3 抗菌素类药物分析中的应用 抗菌素种类繁多，临床应用广泛，依据化学结构的不同，可分为B_内酰胺类抗菌素、氨基糖苷类抗菌素、四环素类抗菌素、氟喹诺酮类抗菌素等。HPLC分析技术近年来在抗生素的质量控制中已广泛应用。对结构、组分等较清楚的药物，HPLC分析将逐步取代传统的生物测定。目前，各国药典中应用HPLC技术对抗生素进行质量控制的项目包括鉴别、组分分析、含量测定和相关物质测定等。如青霉素有效成分的分离可采用反相键合色谱法，硫酸庆大霉素C组分的含量测定。
2.3.4 手性药物分析中的应用 两种化学组成、分子式完全相同的化合物，但因组成化合物的原子在空间取向不同，而成为镜像的化合物，或称为手性化合物。由于对映体的物理、化学性质相同，实现它们的分离就比较困难，如大多数氨基酸都有右旋体和左旋体，但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物。对于手性药物往往呈现一种对映体具有强的生物活性和药效，而另一种却无效。手性药物HPLC法现已成为手性药物质量控制和新药研发中应用最为广泛的技术。如对酮康唑外消旋体采用C18键合固定相，以磺丁基-B-环糊精为手性流动相添加剂进行拆分而使酮康唑的右旋体和左旋体得以分离。
2.4 生物药物分析中的应用 生物药物是从动、植物、微生物中提取的、生物-化学半合成的或用现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物。包括生化药物和生物制品等。例如中国药典对重组人生长激素、重组人胰岛素、重组人粒细胞集落刺激因子的鉴别。
2.5 在血药浓度检测中的应用 药物在体内经过吸收、分布，可形成一定的血药浓度，利用高效液相色谱法可监测药物的血药浓度，保证用药安全。如对乙酰氨基酚急性中毒的血药浓度的检测：对乙酰氨基酚是临床上使用极其广泛的解热镇痛药，由于患者状态的多样性以及对酰氨基酚中毒的早期症状与胃溃疡症状极其相似且肝功正常，故常常发生漏诊，等到发生肝损伤已经错过了治疗最佳时机。因此，国外已将对乙酰氨其酚血浓度作为急诊中毒病人常规检测。色谱条件：采用Nova-PakC18柱（4μm，150mm×3.9mm），柱温25℃；流动相为甲醇-水（30：30），流速为0.8ml/min；二极管阵列检测器，检测波长254nm。血浆样品制备；取静脉血3ml-4ml，置含肝素抗凝剂的离心管中，离心分离5min（3000r/min），上清液为待测血浆。取上述血浆1ml，加饱和硫酸锌溶液1ml，沉淀蛋白后，加入乙醚5ml，涡漩混合1min，离心20min（3000r/min）。精密吸取乙醚液3.0ml于50℃氮气流吹干，冷至室温，以蒸馏水500μl溶解残渣，取10μl进样。对照品溶液制备；配制对乙酰氨基酚甲醇溶液（10mg/ml），并用甲醇逐级稀释成浓度为0.01mg/ml-5mg/ml的对照品溶液，4℃冰箱存放备用。血浆中对乙酰氨基酚标准曲线制备；取肝素抗凝的血浆1ml，分别加入不同浓度的对乙酰氨基酚工作液100μl，使血浆中药物浓度为0.9μg/ml-454.5μg/ml，再按“血浆样品制备”项下方法操作，记录色谱图，以溶液C对峰面积A作线性回归，得回归方程：A=1.64×104+1.68×107C，R=0.9995，线性范围为0.9μg/ml-454.5μg/ml，最低检测浓度为0.9μg/ml（以信噪比≥3计）。用HPLC测定可疑中毒病人血中对乙酰氨基酚浓度具有准确、快速的优点，可有效地帮助临床医生确诊，快速有效地救治患者，对提高医疗质量有重要意义。 2.6 天然药物分析中的应用 由于天然药物的化学成分复杂，对于控制药品质量，建立质量标准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行分离鉴定，再测定有效成分的含量；通过指纹图谱建立识别模式，可以判定药材的质量高低。
3 高效色谱法在药物分析的研究动向及应用进展
3.1 检测手段的进步 近年来，高效液相色谱教重要的发展方面是检测器的发展，如二极管阵列检测器和高效液相蒸发激光散射检测器，可以用高效液相二极管阵列检测器分离检测银杏等叶中黄酮成分，用高效液相蒸发激光散射检测器测定银杏叶提取物中内酯的含量等。仪器的进一步发展，HPLC在药物分析中会成为更加有效的高灵敏度的方法和可操作性。
3.2 二（多）维色谱 为了从复杂样品中分离或定量某一特定成分，可采用两种或两种以上的不同的色谱方法，即采用二维或多维色谱，多维色谱能够灵活应用传统HPLC，在复杂生物样品的分析中表现出一定的优势，有着广泛的应用前景。
3.3 色谱技术的联用 目前，对某一复杂样品的分析很难用单一分析分离方法解决，使用HPLC联用技术是发展趋势之一。如液相色谱—质谱技术联用可用于药物代谢研究、天然产物快速分析以及生物大分子分析
3.4 微液相色谱的研究 由于微液相色谱分析所需的样品量及流动相的消耗大大下降，检测灵敏度又大大提高，相信此法在药物分析中也能发挥它的优点。
4 结论和展望
综上所述，HPLC是現代分离测定的重要手段。由于它具有专属性强、简便快速、灵敏度高等特点，既可用于分离也可用于定量分析，适用于各种各样的有机化合物，因此目前在药物成分的分离与测定方面得到了广泛的应用。相信随着检测手段的进步、各种联用技术的出现以及其他一些相关问题的解决，HPLC在医药研究中将会发挥越来越重要的作用。
参考文献
[1] 中国药典委员会.中国药典（2010年版）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.
[2] 姚彤炜.药物分析[M].杭州：浙江大学出版社，2011.5.
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[4] 王绪明，白林.高效液相色谱及其联用技术在药物分析中的应用新进展（二）[J].解放军药学学报，2004（06）.
[5] 张良晓.高效液相色谱在药物分析中的应用研究进展[J].内蒙古石油化工，2005（07）.
[6] 周南.液相色谱法及其相关技术的最新进展[J].上海化工，2001（01）.
[7] 黄永焯，王宁生.HPLC/ELSD在天然药物分析中的应用[J].中药新药与临床药理，2001（12）6：78.