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摘要目的：本研究观察了时令季节变化对下丘脑垂体甲状腺（HPT）轴功能的影响，以证实“四时五藏阴阳”理论的科学内涵。方法：检测了雄性金黄地鼠血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4及甲状腺组织中MT、MR、T3、T4的含量。结果：发现血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4含量呈现冬、春/秋高而夏至最低的变化趋势，甲状腺组织中MT、MR、T3、T4含量则呈现夏至最高而秋冬最低的变化趋势。结论：HPT轴的功能具有明显的季节相关性，在冬、春季节其机能相对增强，褪黑素可能为其季节性节律的调控因子，HPT轴的季节性功能变化为中医“四时五藏阴阳”理论提供了生物学依据。
关键词四时五藏阴阳；褪黑素；下丘脑垂体甲状腺；时令季节；肾应冬
Discussion on Biological Basis of “Yinyang of the Four Seasons and the Five Viscera”——Effects
of Seasons on the Functional Rhythm of HypothalamicPituitaryThyroid Axis
Han Junge1， Yang Zongchun2， Zhang Na2， Liu Xu2， Liu Xiaoyan2， Yuan Tao1， Wang Xiaofei1， Wang Sumei1， Guo Xiazhen2
（1 Beijing Fangshan Traditional Chinese Medicine Hospital， Beijing 102488， China；
2 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）
AbstractObjective：To systematically observe the effects of seasonal changes on the function of the hypothalamuspituitarythyroid （HPT） axis to verify the scientific connotation of the “yinyang of the four seasons and the five viscera” theory. Methods：The contents of MT， TRH， TSH， T3， T4 in plasma and MT， MR， T3， and T4 in the thyroid tissue of male golden hamster were measured. Results：The results showed that the contents of MT， TRH， TSH， T3， and T4 in plasma showed the highest changes in winter， spring/autumn， and lowest in summer solstice. The contents of MT， MR， T3， and T4 in thyroid tissue showed the highest changes in summer solstice and lowest in autumn and winter. Conclusion：The function of HPT axis has obvious seasonal correlation， and its function is relatively enhanced in winter and spring. Melatonin may be a regulatory factor of this seasonal rhythm. The seasonal function change of HPT axis provides a biological basis for “yinyang of the four seasons and the five viscera” theory.
Key WordsYinyang of the four seasons and the five viscera； Melatonin； Hypothalamuspituitarythyroid； Seasons； Kidney corresponding with winter
中图分类号：R221；R2231+1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.007
《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论认为人体与自然外界是一个有机的整体。自然阴阳之气的运动既是形成四时之气寒热温凉变化的基础，也是万物生长壮老已生命活动形成的基础，两者共同遵循着阴阳消长运动的基本规律，这就是“天人相应”观的核心内容。古代医家遵循这一思想，从可见的外在之象探讨人体内在脏腑气血的运行与变化，形成了包括内在有形之脏和与其相关的外在可见的功能表现（象），加上自然万物相应的同步变化之象，建立了中医学独特的脏腑概念，并称之为“藏象”。此观点一直指导着中医理论的发展和中医临床的诊断与治疗，成为中医理论体系的核心内容。我们看到随着生物医学的发展，对与现代西医学存在差异的中医学“藏象”理论内涵的探讨，日益受到人们的关注。《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论从人体与自然为一个整体，存在着同步调节规律的理论观点，为我们以此为切入点，探讨中医“藏象”本质的科学内涵提供了思路与方法。自20世纪80年代开始，由程士徳教授主导的《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论研究团队经过多年的研究认识到：中医五脏概念不仅是对其结构与功能的概括，还包含着时间的含义，时间特性是五脏概念的重要内容之一。有关中医五脏概念的研究，不能只从结构与功能、生理与病理、药物治疗效应等方面来进行，还必须重视五脏功能的时间特性。只有全面考虑五脏功能表现的各个方面，其研究结果才能真正反映中医五脏的实质[1]。研究还提出五脏是由实质器官为基础组成的功能单位，并与自然相应，体现了人体生命活动与自然四时阴阳消长存在协调共振的規律，其实质是内在脏腑功能生化代谢的一种特定模式，与既有物质基础又能体现生物整体功能表达的生物信息传导系统有密切的关系[2]。为此本研究选择了下丘脑、垂体、甲状腺共同构成的下丘脑垂体甲状腺（Hypothalamuspituitarythyroid，HPT）轴，作为观察的对象，欲从对全身多项生理机能有调节作用的内分泌腺应时变化的角度，阐释上述观点的科学内涵。下丘脑、垂体、甲状腺共同构成的下丘脑垂体甲状（Hypothalamuspituitarythyroid，HPT）轴，参与人体应激反应、物质代谢、生长发育、神经调节、产热效应、繁殖活动等生命活动，随外界气候温度寒热刺激可进行自身调节。因此，学者们认为它是机体继下丘脑垂体肾上腺（HPA）轴外，随外界环境而适应性调节的又一神经内分泌轴，共同调节机体以适应外界环境的变化。研究还发现，机体肾上腺皮质激素的年节律变化，与总T3含量具有明显相关性，即具有同步性季节变化规律[3]。比如当遇到外界环境寒冷的情况，刺激机体可促使下丘脑TRH神经元释放增加，从而增加TSH，直至T3、T4的释放。因此，研究时令季节变化对HPT轴的影响对证实“四时五藏阴阳”理论的科学内涵具有重要意义。本实验从四时季节HPT轴各水平生理状态下相关激素、MT及褪黑素受体（Melatonin Receptor，MR）含量的变化切入，探讨甲状腺功能与季节气候的关系及褪黑素在其中参与的作用机制，拟为“四时五藏阴阳”理论的科学内涵提供生物学依据。 1材料与方法
11材料
111动物金黄地鼠32只，SPF级，健康雄性，体重（130±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）20120001；饲料由北京维通利华实验动物中心提供的普通鼠全价颗粒饲料。实验动物分别于春分、夏至、秋分、冬至前2周购入，饲养条件：自然光照，湿度50%～70%，室温冬季（18±2）℃，夏季（25±2）℃。
112试剂与仪器仓鼠褪黑素（MT）酶联免疫试剂盒（Lot：80079HA）、仓鼠褪黑素受体酶联免疫试剂盒（Lot：80101HA）、仓鼠促甲状腺素释放激素酶联免疫试剂盒（Lot：80309HA）、仓鼠促甲状腺素酶联免疫试剂盒（Lot：80280HA）、仓鼠三碘甲状腺原氨酸酶联免疫试剂盒（Lot：80258HA）、仓鼠甲状腺素酶联免疫试剂盒（Lot：80259 HA）、总蛋白试剂盒（Lot：20130720008），以上试剂均由北京瑞格博科技发展有限公司提供。
酶标仪：Thermo Multiskan MK3（产地：芬兰）；生化仪：Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron（产地：美国）；孵育箱：泰斯特1011AB型电热恒温鼓风箱（产地：中国）；洗板机：SUNOSTIK SAR520B（产地：中国）；离心机：Beckman低温高速离心机（产地：美国）；电子天平：Mettler Toledo ML3002（产地：瑞士）；电动匀浆机：BOST S1JSFC32。
12方法
121干预方法将实验动物分为春分组、夏至组、秋分组、冬至组，每组8只，分别于春分、夏至、秋分、冬至日前自然光照条件饲养2周，至春分、夏至、秋分、冬至日傍晚将动物移至暗室，当晚22：00开始取材。取材：在暗室内5 w红光灯照射下进行，10%水合氯醛3～4 mL/kg腹腔注射麻醉，行腹主动脉采血3～4 mL，注入肝素抗凝试管内，颠倒混匀，血液静置2 h后，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min，分离血浆，-20 ℃冻存备测。在颈部分离周围组织，取出甲状腺，于生理盐水中洗去血污后投入液氮中，实验结束后放入-80 ℃冰箱中待检。
122指标检测与方法将取出的血浆、甲状腺，分别用酶联免疫吸附试验（ELISA）法，依照试剂盒说明书对所取样本进行处理，检测血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4含量，检测甲状腺组织中MT、MR、T3、T4的含量。
13统计学方法各组数据均用均数±标准差（±s）表示，运用SPSS 200统计软件分析。各组之间数据符合正态分布且方差齐者，采用单因素方差分析；数据分布非正态或者方差不齐时，采用非参数检验中的K个独立样本的方法统计；两两比较时，方差齐且数据分布呈正态者，用独立样本t检验，否则则用非参数检验中2个独立样本。以P<005为差异有统计学意义。
2结果
我们首先对不同时令季节实测到的春分组、夏至组、秋分组、冬至组金黄地鼠血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4的含量，以及甲状腺组织中MT、MR、T3、T4的含量，分别对2个样本的测定值进行了组间的比较分析，各数值组间比较，差异均具有统计学意义（P<001）。由此说明，不同的时令季节对人体内
分泌系统的影响和作用是不同的，人与自然外界相通应。《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论认为，五脏分别与五行相应之脏互为通应，为了作进一步了解不同时令节气间对人体的不同影响规律，我们对不同时令节气日采集的样本测定值做了对比分析，结果如下。
21时令节气与金黄地鼠血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4含量的相关性变化1）血浆中MT含量比较，冬夏、冬秋、春夏、春秋、夏秋之间差异均有统计学意义（P<005或P<001）。2）血浆中TRH含量比较，冬夏之间差异有统计学意义（P<005）。3）血浆中TSH含量比较，春、夏、秋、冬各季之间差异有统计学意义（P<005或P<001）。4）血浆中T3含量比较，春、夏、秋、冬各季之间差异均存在统计学意义（P<005或P<001）；5）血漿中T4含量比较，冬夏之间差异存在统计学意义（P<001）。实验结果说明：在不同时令季节里，金黄地鼠血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4含量不同，结果均呈现出与季节变化相关的变化；同时还见到冬、春相对高而夏至最低的趋势，以及TSH与T4 2项明显的差异。见表1。
图1、2显示：在自然春分、夏至、秋分、冬至不同时令，血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4含量的变化，呈现冬、春/秋高而夏至最低的同步性趋势。同时见到MT、T3、T4的含量在夏季是明显降低，冬季的含量高于夏季，呈现出同步的规律性变化。由此，提示HPT的功能存在季节性的变化规律。时令季节的形成与阳光对地球的照射角度有关，在我国所在的地区就呈现出春分与秋分昼夜平分；夏至是一年中白天最长夜晚最短；反之冬至是一年中白天最短夜晚最长，由此可以说阳光的亮度与照度在不同季节中是不同的。正如：《素问·脉要精微论》篇第十七所言，“冬至四十五日，阳气微上，阴气微下；夏至四十五日，阴气微上，阳气微下。阴阳有时，与脉为期……生之有度，四时为宜，补泻勿失，与天地如一”，由此强调了时令季节不同与阴阳气的消长运动变化有关。据此，我们根据本团队的前期研究证实，受光照影响的松果腺，在内分泌系统中它属于上位调节器，松果腺对MT的分泌受到光照的调节，然而MT又能直接作用于甲状腺产生调节作用。于是实验又对实验动物甲状腺组织中MT、MR、T3、T4含量进行了比较与分析。
结果可见，甲状腺组织中MT、MR、T3、T4含量在不同的时令节气环境下，产生了变化比较。尤其是冬至与夏至4项数值差异全部有统计学意义，形成了高和低2种相反的现象。
3讨论
31关于HPT轴及其调节的讨论下丘脑腺垂体甲状腺轴（也用HPT表示），它是由下丘脑分泌促甲状腺激素释放激素（TRH），以促进腺垂体分泌促甲状腺激素（TSH），腺垂体分泌促甲状腺激素以促进甲状腺分泌甲状腺素，调节正常甲状腺功能，以参与机体各项生理活动的内分泌轴。生理上TRH通过垂体门静脉系统运送到腺垂体，以高亲和力结合于促甲状腺激素细胞膜上的TRH受体，促进TSH的合成和分泌。TSH与甲状腺滤泡上皮细胞上的TSH受体结合，促进甲状腺素（TH）的释放。TSH一方面促进甲状腺激素的合成与释放，另一方面其本身的合成与分泌又受下丘脑TRH的刺激和甲状腺素的负反馈抑制作用，它们组成了下丘脑垂体甲状腺轴，以此构成了HPT轴的调节。因此，人体的生理机能与这三者分泌的三碘甲状腺原氨酸（T3）和四碘甲状腺原氨酸（T4），以及TSH、TRH激素量的变化有关。 另由于TRH广泛分布于中枢神经系统和周围神经系统，其中在下丘脑正中隆起含有TRH神经元，30%的TRH分布在中枢神经系统，如损毁下丘脑，则TSH水平下降，近日节律消失。
此外，中枢神经系统递质DA具有抑制TRH的作用；肾上腺素、去甲肾上腺素对TSH的分泌具有兴奋作用；寒冷、应激等也能促进TRH分泌增加，并引起TSH分泌增加，并引起血清T3、T4的升高。可以说HPT与神经系统又紧密联系，相互作用，相互配合，被称为两大生物信息系统，它们的密切配合，成为维持机体的内环境相对稳定的条件之一。除了TSH和上述物质对甲状腺的调节外，甲状腺自身也具有调节作用，即甲状腺自身表现出来的对碘的摄取、TH的合成和分泌的调节作用，在垂体摘除及TSH原发性减少的机体，这种作用仍可以看到。
32HPT轴的季节特点与褪黑素相关关系的讨论关于甲状腺轴季节性变化特点，吴安国等[4]通过对去势幼龄公山羊和小绵羊血清中TSH的四季含量检测，结果均显示，其TSH存在明显的季节差异，即秋冬严寒气候下含量最高，随春夏气温变暖而降低，形成冬季最高、夏季最低而春秋居中的规律，并且在不同个体之间差异性较大；在检测四季中去势绵羊和山羊昼夜血清中T3、T4的含量时，发现T3、T4也存在夏季最低、冬季最高的趋势，且具有昼夜节律变化，且昼夜峰谷的时间与季节具有相关性[5]。
动物和人的TSH的基础分泌表现为脉冲式分泌，其中人为每2～6 h分泌出现一次高峰，另外分泌还呈现近日节律，在人睡眠开始前几个小时血清TSH开始增加，23：0004：00达高峰，以后逐漸下降，上午约11时为最低值。目前对其近日节律的机制尚不完全清楚，但是甲状腺功能状态、糖皮质激素水平、松果体功能状态等对TSH分泌的近日节律有一定影响的研究，还是受到了研究者的关注。尤其是对于褪黑素与生物昼夜节律的相关研究，更受到人们的重视。实验证实，在哺乳动物的下丘脑[6]垂体[7]及甲状腺[8]组织中均存在褪黑素受体MT1/MT2，由此推论，褪黑素除能直接作用于甲状腺外，也可以通过下丘脑、垂体进行调控。研究还指出在鸟类，褪黑素节律是影响其季节性反应的独立因素；在哺乳动物内分泌系统非常复杂，研究显示，当摘除松果腺时，其季节性反应消失，而给予褪黑素后则又恢复[9]，说明褪黑素也是调整生物生理活动季节性规律的关键因素。
在对褪黑素与HPT轴相关的研究中，人们通过摘除松果腺、持续光照、持续黑暗、腹腔注射TRH及给予MT、MT+TRH等不同情况对大鼠垂体、血中TSH、T4水平进行对比实验，发现松果腺对下丘脑的TRH分泌具有抑制作用[10]；褪黑素通过抑制垂体结节部TSH的分泌和合成[11]，调节TSH浓度的昼夜变化；高剂量的褪黑激素可以抑制啮齿类动物体内甲状腺滤泡细胞的有丝分裂活动，从而对T4的分泌产生直接的抑制作用、降低其对TSH的反馈作用[12]。
本课题组前期在对褪黑素与HPT轴调节关系的研究中[13]，通过对健康志愿者、大鼠冬夏季节血清中TRH、TSH、T3、T4含量的测定，也发现褪黑素与HPT轴的冬夏节律性具有关联性，松果腺分泌的MT对其节律性有调控作用。本次我们对血清、甲状腺组织中MT、MR、TRH、TSH、T3、T4含量的测定扩大到了四季，在观察全年变化的基础上，对MT与HPT轴的季节调节关系，进行了研究。研究结果见到：1）血中TRH、TSH、T3、T4含量四个时令节气的测定结果进行比较，均呈现冬、春/秋高而夏至最低的趋势，与血中MT的时令变化趋势相同，即MT与血清中HPT轴相应各激素呈现正相关性关系。2）对甲状腺组织中MT、MR、T3、T4含量四个时令节气的测定结果进行比较，均显示出夏至最高、冬至最低的一致性变化趋势，这与血清中相应MT、T3、T4含量季节性趋势完全相反。这与冬、春短光照、低气温的寒冷季节，血清褪黑素分泌较多，HPT轴各水平层次上激素分泌量增多，但甲状腺组织中褪黑素及其含量、组织中甲状腺素量均较少相关，夏季则呈相反趋势。血清中褪黑素及TRH、TSH、TH的实验结果，与本课题组前期对甲状腺轴的冬、夏季节研究结果相符[14]。学者Maes M等[3]等通过对一年中二分二至4次血浆中激素水平的监测结果显示，健康志愿者血浆中TSH、TT3存在典型的年节律，表现为峰值在冬季，而谷值在夏季；另外，对健康受试者一年中血中TSH、甲状腺素的监测结果显示，TSH、T3血清浓度与季节相关，高浓度出现在冬季，说明甲状腺轴存在随环境温度调节的特点[15]。当外界环境温度降低时，甲状腺素分泌增多，产生热量增加。因此，Vriend J等[16]认为，褪黑素对HPT轴的调节具有双重性：一方面通过抑制性作用来抑制甲状腺的活动，另一方面当外界环境急剧变化时可直接刺激甲状腺，引起甲状腺素释放入血，从而起到调节作用。从实验数据分析褪黑素与HPT轴的分泌调节存在同步协调的关系，HPT轴相关物质的季节性变动，必然会导致人体生理机能出现相应的季节性变化。因此，本实验进一步证实《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论，所指出的人与自然是一个有机的整体，通过分析人体不同季节所表现与外的规律性现象，分析内在脏腑组织的功能变化是可以成立的，具有科学的依据。
33HPT轴时令节气变化与“四时五藏阴阳”理论的相关性讨论《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论认为五脏应四时，各有收受，即它认为人是与自然相互通应的一个整体，但是五脏又分别与五时相应，具体内容包括肝应春、心应夏、肺应秋、肾应冬、脾应长夏。也就是说不同的脏在不同的时令季节，其功能活动表现于外的现象有所差别。比如肝应春，则指肝在春季其气旺，功能会加强，依次心气旺于夏、肺气旺于秋、肾旺于冬、脾旺于长夏。HPT轴最终会分泌甲状腺素。甲状腺素具有增加组织产热效应、促进物质代谢、促进组织分化，影响机体中枢神经系统；在调节体内钙的平衡，促进生长发育，对长骨、脑和生殖器官的发育生长具有至关重要的作用。中医学认为在人体五脏中，肾具有主藏精、主生长发育、主骨生髓，及温煦脏腑的功能。相对来说，甲状腺激素的生理效应与中医肾的功能多有相似。临床上甲状腺功能减退者常出现面浮身肿、畏寒怕冷、发育迟缓等肾精肾阳不足的证候，而甲状腺功能亢进则表现为怕热多汗、焦虑烦躁、失眠多动、肢体颤动等阴虚内热的证候。给予甲硫咪唑片造模成功的肾阳虚大鼠，血清T3、T4水平较对照组下降，给予盐巴戟后显著升高[17]。 本研究除发现HPT轴机能变化具有明显的季节节律性外，在对金黄地鼠血浆中TRH、TSH、T3、T4含量的比较，中可见到四项指标冬至与夏至明显的不同（P<001），具有统计学意义呈现春、冬高而夏至最低的趋势，即在冬、春寒冷季节HPT轴机能相对活跃，内分泌功能处于相对增强状态，从而适应外界自然环境，也为中医“肾应冬”理论增加了新的依据。为中医“四时五藏阴阳”理论提供了生物学依据。
参考文献
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（2018-04-15收稿责任编辑：徐颖）（上接第1075页）
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AbstractObjective：To systematically observe the effects of seasonal changes on the function of the hypothalamuspituitarythyroid （HPT） axis to verify the scientific connotation of the “yinyang of the four seasons and the five viscera” theory. Methods：The contents of MT， TRH， TSH， T3， T4 in plasma and MT， MR， T3， and T4 in the thyroid tissue of male golden hamster were measured. Results：The results showed that the contents of MT， TRH， TSH， T3， and T4 in plasma showed the highest changes in winter， spring/autumn， and lowest in summer solstice. The contents of MT， MR， T3， and T4 in thyroid tissue showed the highest changes in summer solstice and lowest in autumn and winter. Conclusion：The function of HPT axis has obvious seasonal correlation， and its function is relatively enhanced in winter and spring. Melatonin may be a regulatory factor of this seasonal rhythm. The seasonal function change of HPT axis provides a biological basis for “yinyang of the four seasons and the five viscera” theory.
Key WordsYinyang of the four seasons and the five viscera； Melatonin； Hypothalamuspituitarythyroid； Seasons； Kidney corresponding with winter
中图分类号：R221；R2231+1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.007
《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论认为人体与自然外界是一个有机的整体。自然阴阳之气的运动既是形成四时之气寒热温凉变化的基础，也是万物生长壮老已生命活动形成的基础，两者共同遵循着阴阳消长运动的基本规律，这就是“天人相应”观的核心内容。古代医家遵循这一思想，从可见的外在之象探讨人体内在脏腑气血的运行与变化，形成了包括内在有形之脏和与其相关的外在可见的功能表现（象），加上自然万物相应的同步变化之象，建立了中医学独特的脏腑概念，并称之为“藏象”。此观点一直指导着中医理论的发展和中医临床的诊断与治疗，成为中医理论体系的核心内容。我们看到随着生物医学的发展，对与现代西医学存在差异的中医学“藏象”理论内涵的探讨，日益受到人们的关注。《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论从人体与自然为一个整体，存在着同步调节规律的理论观点，为我们以此为切入点，探讨中医“藏象”本质的科学内涵提供了思路与方法。自20世纪80年代开始，由程士徳教授主导的《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论研究团队经过多年的研究认识到：中医五脏概念不仅是对其结构与功能的概括，还包含着时间的含义，时间特性是五脏概念的重要内容之一。有关中医五脏概念的研究，不能只从结构与功能、生理与病理、药物治疗效应等方面来进行，还必须重视五脏功能的时间特性。只有全面考虑五脏功能表现的各个方面，其研究结果才能真正反映中医五脏的实质[1]。研究还提出五脏是由实质器官为基础组成的功能单位，并与自然相应，体现了人体生命活动与自然四时阴阳消长存在协调共振的規律，其实质是内在脏腑功能生化代谢的一种特定模式，与既有物质基础又能体现生物整体功能表达的生物信息传导系统有密切的关系[2]。为此本研究选择了下丘脑、垂体、甲状腺共同构成的下丘脑垂体甲状腺（Hypothalamuspituitarythyroid，HPT）轴，作为观察的对象，欲从对全身多项生理机能有调节作用的内分泌腺应时变化的角度，阐释上述观点的科学内涵。下丘脑、垂体、甲状腺共同构成的下丘脑垂体甲状（Hypothalamuspituitarythyroid，HPT）轴，参与人体应激反应、物质代谢、生长发育、神经调节、产热效应、繁殖活动等生命活动，随外界气候温度寒热刺激可进行自身调节。因此，学者们认为它是机体继下丘脑垂体肾上腺（HPA）轴外，随外界环境而适应性调节的又一神经内分泌轴，共同调节机体以适应外界环境的变化。研究还发现，机体肾上腺皮质激素的年节律变化，与总T3含量具有明显相关性，即具有同步性季节变化规律[3]。比如当遇到外界环境寒冷的情况，刺激机体可促使下丘脑TRH神经元释放增加，从而增加TSH，直至T3、T4的释放。因此，研究时令季节变化对HPT轴的影响对证实“四时五藏阴阳”理论的科学内涵具有重要意义。本实验从四时季节HPT轴各水平生理状态下相关激素、MT及褪黑素受体（Melatonin Receptor，MR）含量的变化切入，探讨甲状腺功能与季节气候的关系及褪黑素在其中参与的作用机制，拟为“四时五藏阴阳”理论的科学内涵提供生物学依据。 1材料与方法
11材料
111动物金黄地鼠32只，SPF级，健康雄性，体重（130±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）20120001；饲料由北京维通利华实验动物中心提供的普通鼠全价颗粒饲料。实验动物分别于春分、夏至、秋分、冬至前2周购入，饲养条件：自然光照，湿度50%～70%，室温冬季（18±2）℃，夏季（25±2）℃。
112试剂与仪器仓鼠褪黑素（MT）酶联免疫试剂盒（Lot：80079HA）、仓鼠褪黑素受体酶联免疫试剂盒（Lot：80101HA）、仓鼠促甲状腺素释放激素酶联免疫试剂盒（Lot：80309HA）、仓鼠促甲状腺素酶联免疫试剂盒（Lot：80280HA）、仓鼠三碘甲状腺原氨酸酶联免疫试剂盒（Lot：80258HA）、仓鼠甲状腺素酶联免疫试剂盒（Lot：80259 HA）、总蛋白试剂盒（Lot：20130720008），以上试剂均由北京瑞格博科技发展有限公司提供。
酶标仪：Thermo Multiskan MK3（产地：芬兰）；生化仪：Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron（产地：美国）；孵育箱：泰斯特1011AB型电热恒温鼓风箱（产地：中国）；洗板机：SUNOSTIK SAR520B（产地：中国）；离心机：Beckman低温高速离心机（产地：美国）；电子天平：Mettler Toledo ML3002（产地：瑞士）；电动匀浆机：BOST S1JSFC32。
12方法
121干预方法将实验动物分为春分组、夏至组、秋分组、冬至组，每组8只，分别于春分、夏至、秋分、冬至日前自然光照条件饲养2周，至春分、夏至、秋分、冬至日傍晚将动物移至暗室，当晚22：00开始取材。取材：在暗室内5 w红光灯照射下进行，10%水合氯醛3～4 mL/kg腹腔注射麻醉，行腹主动脉采血3～4 mL，注入肝素抗凝试管内，颠倒混匀，血液静置2 h后，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min，分离血浆，-20 ℃冻存备测。在颈部分离周围组织，取出甲状腺，于生理盐水中洗去血污后投入液氮中，实验结束后放入-80 ℃冰箱中待检。
122指标检测与方法将取出的血浆、甲状腺，分别用酶联免疫吸附试验（ELISA）法，依照试剂盒说明书对所取样本进行处理，检测血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4含量，检测甲状腺组织中MT、MR、T3、T4的含量。
13统计学方法各组数据均用均数±标准差（±s）表示，运用SPSS 200统计软件分析。各组之间数据符合正态分布且方差齐者，采用单因素方差分析；数据分布非正态或者方差不齐时，采用非参数检验中的K个独立样本的方法统计；两两比较时，方差齐且数据分布呈正态者，用独立样本t检验，否则则用非参数检验中2个独立样本。以P<005为差异有统计学意义。
2结果
我们首先对不同时令季节实测到的春分组、夏至组、秋分组、冬至组金黄地鼠血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4的含量，以及甲状腺组织中MT、MR、T3、T4的含量，分别对2个样本的测定值进行了组间的比较分析，各数值组间比较，差异均具有统计学意义（P<001）。由此说明，不同的时令季节对人体内
分泌系统的影响和作用是不同的，人与自然外界相通应。《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论认为，五脏分别与五行相应之脏互为通应，为了作进一步了解不同时令节气间对人体的不同影响规律，我们对不同时令节气日采集的样本测定值做了对比分析，结果如下。
21时令节气与金黄地鼠血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4含量的相关性变化1）血浆中MT含量比较，冬夏、冬秋、春夏、春秋、夏秋之间差异均有统计学意义（P<005或P<001）。2）血浆中TRH含量比较，冬夏之间差异有统计学意义（P<005）。3）血浆中TSH含量比较，春、夏、秋、冬各季之间差异有统计学意义（P<005或P<001）。4）血浆中T3含量比较，春、夏、秋、冬各季之间差异均存在统计学意义（P<005或P<001）；5）血漿中T4含量比较，冬夏之间差异存在统计学意义（P<001）。实验结果说明：在不同时令季节里，金黄地鼠血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4含量不同，结果均呈现出与季节变化相关的变化；同时还见到冬、春相对高而夏至最低的趋势，以及TSH与T4 2项明显的差异。见表1。
图1、2显示：在自然春分、夏至、秋分、冬至不同时令，血浆中MT、TRH、TSH、T3、T4含量的变化，呈现冬、春/秋高而夏至最低的同步性趋势。同时见到MT、T3、T4的含量在夏季是明显降低，冬季的含量高于夏季，呈现出同步的规律性变化。由此，提示HPT的功能存在季节性的变化规律。时令季节的形成与阳光对地球的照射角度有关，在我国所在的地区就呈现出春分与秋分昼夜平分；夏至是一年中白天最长夜晚最短；反之冬至是一年中白天最短夜晚最长，由此可以说阳光的亮度与照度在不同季节中是不同的。正如：《素问·脉要精微论》篇第十七所言，“冬至四十五日，阳气微上，阴气微下；夏至四十五日，阴气微上，阳气微下。阴阳有时，与脉为期……生之有度，四时为宜，补泻勿失，与天地如一”，由此强调了时令季节不同与阴阳气的消长运动变化有关。据此，我们根据本团队的前期研究证实，受光照影响的松果腺，在内分泌系统中它属于上位调节器，松果腺对MT的分泌受到光照的调节，然而MT又能直接作用于甲状腺产生调节作用。于是实验又对实验动物甲状腺组织中MT、MR、T3、T4含量进行了比较与分析。
结果可见，甲状腺组织中MT、MR、T3、T4含量在不同的时令节气环境下，产生了变化比较。尤其是冬至与夏至4项数值差异全部有统计学意义，形成了高和低2种相反的现象。
3讨论
31关于HPT轴及其调节的讨论下丘脑腺垂体甲状腺轴（也用HPT表示），它是由下丘脑分泌促甲状腺激素释放激素（TRH），以促进腺垂体分泌促甲状腺激素（TSH），腺垂体分泌促甲状腺激素以促进甲状腺分泌甲状腺素，调节正常甲状腺功能，以参与机体各项生理活动的内分泌轴。生理上TRH通过垂体门静脉系统运送到腺垂体，以高亲和力结合于促甲状腺激素细胞膜上的TRH受体，促进TSH的合成和分泌。TSH与甲状腺滤泡上皮细胞上的TSH受体结合，促进甲状腺素（TH）的释放。TSH一方面促进甲状腺激素的合成与释放，另一方面其本身的合成与分泌又受下丘脑TRH的刺激和甲状腺素的负反馈抑制作用，它们组成了下丘脑垂体甲状腺轴，以此构成了HPT轴的调节。因此，人体的生理机能与这三者分泌的三碘甲状腺原氨酸（T3）和四碘甲状腺原氨酸（T4），以及TSH、TRH激素量的变化有关。 另由于TRH广泛分布于中枢神经系统和周围神经系统，其中在下丘脑正中隆起含有TRH神经元，30%的TRH分布在中枢神经系统，如损毁下丘脑，则TSH水平下降，近日节律消失。
此外，中枢神经系统递质DA具有抑制TRH的作用；肾上腺素、去甲肾上腺素对TSH的分泌具有兴奋作用；寒冷、应激等也能促进TRH分泌增加，并引起TSH分泌增加，并引起血清T3、T4的升高。可以说HPT与神经系统又紧密联系，相互作用，相互配合，被称为两大生物信息系统，它们的密切配合，成为维持机体的内环境相对稳定的条件之一。除了TSH和上述物质对甲状腺的调节外，甲状腺自身也具有调节作用，即甲状腺自身表现出来的对碘的摄取、TH的合成和分泌的调节作用，在垂体摘除及TSH原发性减少的机体，这种作用仍可以看到。
32HPT轴的季节特点与褪黑素相关关系的讨论关于甲状腺轴季节性变化特点，吴安国等[4]通过对去势幼龄公山羊和小绵羊血清中TSH的四季含量检测，结果均显示，其TSH存在明显的季节差异，即秋冬严寒气候下含量最高，随春夏气温变暖而降低，形成冬季最高、夏季最低而春秋居中的规律，并且在不同个体之间差异性较大；在检测四季中去势绵羊和山羊昼夜血清中T3、T4的含量时，发现T3、T4也存在夏季最低、冬季最高的趋势，且具有昼夜节律变化，且昼夜峰谷的时间与季节具有相关性[5]。
动物和人的TSH的基础分泌表现为脉冲式分泌，其中人为每2～6 h分泌出现一次高峰，另外分泌还呈现近日节律，在人睡眠开始前几个小时血清TSH开始增加，23：0004：00达高峰，以后逐漸下降，上午约11时为最低值。目前对其近日节律的机制尚不完全清楚，但是甲状腺功能状态、糖皮质激素水平、松果体功能状态等对TSH分泌的近日节律有一定影响的研究，还是受到了研究者的关注。尤其是对于褪黑素与生物昼夜节律的相关研究，更受到人们的重视。实验证实，在哺乳动物的下丘脑[6]垂体[7]及甲状腺[8]组织中均存在褪黑素受体MT1/MT2，由此推论，褪黑素除能直接作用于甲状腺外，也可以通过下丘脑、垂体进行调控。研究还指出在鸟类，褪黑素节律是影响其季节性反应的独立因素；在哺乳动物内分泌系统非常复杂，研究显示，当摘除松果腺时，其季节性反应消失，而给予褪黑素后则又恢复[9]，说明褪黑素也是调整生物生理活动季节性规律的关键因素。
在对褪黑素与HPT轴相关的研究中，人们通过摘除松果腺、持续光照、持续黑暗、腹腔注射TRH及给予MT、MT+TRH等不同情况对大鼠垂体、血中TSH、T4水平进行对比实验，发现松果腺对下丘脑的TRH分泌具有抑制作用[10]；褪黑素通过抑制垂体结节部TSH的分泌和合成[11]，调节TSH浓度的昼夜变化；高剂量的褪黑激素可以抑制啮齿类动物体内甲状腺滤泡细胞的有丝分裂活动，从而对T4的分泌产生直接的抑制作用、降低其对TSH的反馈作用[12]。
本课题组前期在对褪黑素与HPT轴调节关系的研究中[13]，通过对健康志愿者、大鼠冬夏季节血清中TRH、TSH、T3、T4含量的测定，也发现褪黑素与HPT轴的冬夏节律性具有关联性，松果腺分泌的MT对其节律性有调控作用。本次我们对血清、甲状腺组织中MT、MR、TRH、TSH、T3、T4含量的测定扩大到了四季，在观察全年变化的基础上，对MT与HPT轴的季节调节关系，进行了研究。研究结果见到：1）血中TRH、TSH、T3、T4含量四个时令节气的测定结果进行比较，均呈现冬、春/秋高而夏至最低的趋势，与血中MT的时令变化趋势相同，即MT与血清中HPT轴相应各激素呈现正相关性关系。2）对甲状腺组织中MT、MR、T3、T4含量四个时令节气的测定结果进行比较，均显示出夏至最高、冬至最低的一致性变化趋势，这与血清中相应MT、T3、T4含量季节性趋势完全相反。这与冬、春短光照、低气温的寒冷季节，血清褪黑素分泌较多，HPT轴各水平层次上激素分泌量增多，但甲状腺组织中褪黑素及其含量、组织中甲状腺素量均较少相关，夏季则呈相反趋势。血清中褪黑素及TRH、TSH、TH的实验结果，与本课题组前期对甲状腺轴的冬、夏季节研究结果相符[14]。学者Maes M等[3]等通过对一年中二分二至4次血浆中激素水平的监测结果显示，健康志愿者血浆中TSH、TT3存在典型的年节律，表现为峰值在冬季，而谷值在夏季；另外，对健康受试者一年中血中TSH、甲状腺素的监测结果显示，TSH、T3血清浓度与季节相关，高浓度出现在冬季，说明甲状腺轴存在随环境温度调节的特点[15]。当外界环境温度降低时，甲状腺素分泌增多，产生热量增加。因此，Vriend J等[16]认为，褪黑素对HPT轴的调节具有双重性：一方面通过抑制性作用来抑制甲状腺的活动，另一方面当外界环境急剧变化时可直接刺激甲状腺，引起甲状腺素释放入血，从而起到调节作用。从实验数据分析褪黑素与HPT轴的分泌调节存在同步协调的关系，HPT轴相关物质的季节性变动，必然会导致人体生理机能出现相应的季节性变化。因此，本实验进一步证实《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论，所指出的人与自然是一个有机的整体，通过分析人体不同季节所表现与外的规律性现象，分析内在脏腑组织的功能变化是可以成立的，具有科学的依据。
33HPT轴时令节气变化与“四时五藏阴阳”理论的相关性讨论《黄帝内经》“四时五藏阴阳”理论认为五脏应四时，各有收受，即它认为人是与自然相互通应的一个整体，但是五脏又分别与五时相应，具体内容包括肝应春、心应夏、肺应秋、肾应冬、脾应长夏。也就是说不同的脏在不同的时令季节，其功能活动表现于外的现象有所差别。比如肝应春，则指肝在春季其气旺，功能会加强，依次心气旺于夏、肺气旺于秋、肾旺于冬、脾旺于长夏。HPT轴最终会分泌甲状腺素。甲状腺素具有增加组织产热效应、促进物质代谢、促进组织分化，影响机体中枢神经系统；在调节体内钙的平衡，促进生长发育，对长骨、脑和生殖器官的发育生长具有至关重要的作用。中医学认为在人体五脏中，肾具有主藏精、主生长发育、主骨生髓，及温煦脏腑的功能。相对来说，甲状腺激素的生理效应与中医肾的功能多有相似。临床上甲状腺功能减退者常出现面浮身肿、畏寒怕冷、发育迟缓等肾精肾阳不足的证候，而甲状腺功能亢进则表现为怕热多汗、焦虑烦躁、失眠多动、肢体颤动等阴虚内热的证候。给予甲硫咪唑片造模成功的肾阳虚大鼠，血清T3、T4水平较对照组下降，给予盐巴戟后显著升高[17]。 本研究除发现HPT轴机能变化具有明显的季节节律性外，在对金黄地鼠血浆中TRH、TSH、T3、T4含量的比较，中可见到四项指标冬至与夏至明显的不同（P<001），具有统计学意义呈现春、冬高而夏至最低的趋势，即在冬、春寒冷季节HPT轴机能相对活跃，内分泌功能处于相对增强状态，从而适应外界自然环境，也为中医“肾应冬”理论增加了新的依据。为中医“四时五藏阴阳”理论提供了生物学依据。
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（2018-04-15收稿责任编辑：徐颖）（上接第1075页）
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