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摘 要：环介导等温扩增（LAMP）技术是一种恒温核酸扩增方法，具有较强特异性，并且操作快速简单，具有较高的灵敏度。目前，此技术被广泛应用到多方面，并且具有一定的改进，主要为多重环介导等温扩增技术实现及环介导等温扩增技术和其他技术的联合使用。该文对环介导等温扩增技术在食品检测中的应用进行分析，从而为环介导等温技术的发展及应用提供参考。
关键词：环介导等温扩增；食品检测；微生物检测
中图分类号 TS207.3 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）21-0041-03
环介导等温扩增技术（LAMP）为Notomi等人所发现的恒温核酸扩增技术，与传统PCR技术相比，其避免了不必要的环节，节约时间，并且具有较高的灵敏度。LAMP技术利用2对特异性引物实现目的序列6个区域的退火杂交，通过Bst DNA聚合酶催化作用，基于恒温条件中温育30～60min，能够实现目标序列批量的扩增。其反应结果能够直接通过肉眼观察是否具有白色焦磷酸镁沉淀，从而进行判断，还能够添加羟基酚蓝、钙黄绿素等荧光染料实现显色观察。常规PCR与实时定量PCR技术是现在使用较为广泛的分子生物学检测方法，但是因为PCR方法操作过程较为繁琐，并且时间較长，对于仪器设备具有较高的要求，不能够在临床快速检测中使用。但是LAMP技术具有较强的特异性，并且具有较高的灵敏度，不需要昂贵仪器，能够在现场病原体及基层检测中使用。目前，该方法被逐渐改进，也被广泛应用到食品微生物检测过程中。
1 LAMP的技术原理
双链DNA在65℃左右为动态平衡的状态，任何引物和双链DNA互补的部位实现碱基互补配对延伸的过程中，另外1条链就会脱落成为单链，LAMP的方法就是通过DNA此种特点技术实现的。
LAMP方法4个引物指的是针对靶基因中的6个区域实现设计的，此6个区域在3′端F3c区段、F2c区段、F1c区段及处于5′端的B1区段、B2区段及B3区段（图1）。LAMP方法的2条内引物FIP与BIP，FIP包括TTTT连接子、F1c序列及F2序列，BIP包括TTTT连接子、B1c序列、B2序列，2条外引物分别为F3和B3序列。LAMP引物设计不仅要避免引物二聚体的形成、引物自身的互补及3，端的发夹结构，对于引物距离也具有一定的要求。F3和F2之间、B2和B3之间距离为0～20bp，引物中环的距离为40～60bp，LAMP反应扩增区域距离为120～180bp[1]。
LAMP等温扩增技术反应体系一般为25μL，包括引物、模板DNA、dNTPs、BstDNA聚合酶及缓冲液。其中的内引物浓度为0.8～2.0μmol/L，外引物的浓度为0.2～0.8μmol/L，镁离子的浓度为2～10mmol/L。不同物质混合之后，放到60～65℃中保温60～90min，80℃灭活10min，产物通过2.0%琼脂糖凝胶电泳分析，并且肉眼观察反应体系浊度变化[2]。
2 环介导等温扩增技术的优势
2.1 特异性较高 由于LAMP技术设计的4对引物是将病原微生物特异性基因靶核酸序列作为基础，能够有效识别靶基因中的6个特异序列，将其进行结合能够导致扩增效应的发生，反应混合物中非靶基因DNA并不会被其影响。LAMP一般能够检测RCR中1/100拷贝数，具有较高的检测灵敏度，因此LAMP的灵敏度及特异性较高。
2.2 反应时间较短 LAMP是在恒温条件下扩增反应，在1h之内能够将全部反应实现，与PCR反应过程中的温度循环并不相同，假如将2条环引物添加到反应体系中，能够缩短反应时间。对比PCR方法，LAMP方法反应时间比较短，使用非常简单，能够满足快速检测的需求[3]。
2.3 检测方便 通过LAMP实现多种茎状DNA的合成，并且产生大量焦磷酸根离子，将镁离子添加到反应溶液中，能够产生白色焦磷酸镁沉淀，利用肉眼就能对其进行观察，或者使用浊度仪在400nm光中对浊度进行检测，就能够对是否扩增进行检测。PCR虽然能够产生焦磷酸盐或者磷酸盐离子，但是产生的量比较少，无法用于检测。LAMP方法也能够通过生成的焦磷酸镁沉淀量结合DNA生成量的线形关系，对DNA进行定性及定量分析。
2.4 操作较为简单 LAMP反应扩增实现是在等温条件中进行，对比PCR较为简单，只需要实验室具有水浴锅，直接检测反应后的产物就能够判断，不需要复杂设备和试剂，在快速检测及现场检测过程中非常有利[4]。
3 环介导等温扩增技术在食物检测中的使用
3.1 在食源致病菌中的检测 LAMP技术在食源致病菌检测过程中应用较多，并且方法较为成熟。LAMP在大肠杆菌研究中使用较为广泛并且成熟，对于不同类型的大肠杆菌使用不同的靶序列设计引物实现专门检测。研究人员通过大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因保守区实现引物的设计，创建LAMP技术快速检测的方法。针对肉类中的大肠杆菌O157：H7，利用其特异性抗原rfbE基因和鞭毛H7特异性抗原flic基因成为靶序列，实现环引物改良LAMP引物序列的设计，从而创建快速检测方法，肉眼就能够观察结果，从而实现单管的同时检测。
多类别沙门氏菌能够导致人畜局部的感染性化脓，从而出现败血症或者死亡。研究人员通过沙门氏菌高度保守fimY基因靶序列实现引物设计，创建LAMP反应体系。阳性菌株检测率为100%，此技术对检测牛奶沙门氏菌污染具有一定的灵敏度[5]。
葡萄球菌属于革兰式阳性球菌，部分致病并且为较常见的化脓性球菌。最为常见的就是金黄色葡萄球菌，此菌种LAMP检测方法比较多，可以通过创建LAMP方法检测猪血中金黄色葡萄球菌。凝固酶阳性葡萄球菌会导致人局部化脓性感染，还会出现败血症、肺炎等疾病。针对此菌种特有coa基因实现引物的设计，能够创建具有良好特异性及较高检出率的LAMP检测方法。 阪崎肠杆菌会导致新生儿小肠结肠炎、脑膜炎等，并且具有较高的感染率及死亡率。通过阪崎肠杆菌16S-23SrDNA间区序列实现特异性引物的设计，并且创建LAMP检测方法，此种方法在实现奶粉样品阪崎肠杆菌检测过程中的低限为1.2CFU/100g。
副溶血性孤菌是在各种水产品寄生的有害菌，也是导致人类食物中毒的主要病原体。结合LAMP技术和叠氮溴化乙锭染色，通过副溶血性孤菌tlh基因成为靶序列实现特异性引物的设计，创建快速食品副溶血性孤菌检测的方法，通过此种方法还能够检测克氏蟞虾寄生副溶血性孤菌，其结果和国家标准的检测方法相同[6]。
3.2 在食源致病病毒中的检测 食源病毒主要在家畜、家禽、蔬菜、水产等活体中寄存，会导致活体大量死亡，从而造成经济损失。禽流感病毒（AIV）会导致出现禽类流感，给养禽业造成较大的损失。此病毒为RNA病毒，主要包括16个HA亚型，此亚型能够对人造成感染，或者还会导致死亡。LAMP技术对禽流感病毒检测过程中具有较高的灵敏度，能够在大规模农场家禽感染检测过程中使用。对于H1N1亚型禽流感病毒HA基因及M基因实现2组特异性引物的设计，并且实现LAMP单管快速检测方法的创建，反应结果利用浊度实现判断，最低能够对10拷贝/管病毒颗粒进行检测[7]。
除了禽流感之外，LAMP還能够在其他禽类病毒检测过程中使用。鹅副黏病毒会导致鹅消化道传染病，通过此病毒F基因实现引物设计，创建LAMP检测方法。禽呼肠孤病毒会导致禽类肝炎、心包炎等疾病，对于此病毒p10基因实现引物设计，创建使用钙黄绿色荧光显示结果的LAMP检测。
3.3 在转基因食品中的检测 目前对于是否推广使用转基因食品具有一定的争议，实现灵敏转基因食品检测方法的创建尤为重要。LAMP技术在此方面能够充分发挥作用，其检测转基因食物靶基因为被转化基因的自身，也就是转基因最常使用的启动子。大部分转基因食物中都具有CaMV-35S启动子，所以对其启动子检测就能够判断此食物是否属于转基因。对于人工改造光源cry1Ac基因实现LAMP特意引物的设计，并且通过荧光杏色使用转基因水稻的检测[8]。
3.4 在食品过敏原成分的检测 食物过敏是导致肠道、皮肤和呼吸道等多种急性疾病的主要原因，目前对过敏症的治疗主要方法就是避免食用具有过敏原的食物，要求生产商在食物标签中将导致过敏成分进行标识，避免消费者在不知情的情况下误食导致过敏。目前，国内外常用检测食品过敏原成分方法主要包括核酸检测及免疫学检测[9]。核酸检测具有快速、灵敏及精准的优势，通过深加工的食品，核酸成分还是具有一定稳定性，所以其成为主要检测基础。将8种食物过敏原中的典型产品作为研究对象，对实现具有较高特异性的过敏原基因片段进行筛选，将其作为检测对象，实现LAMP引物的设计，并且实现反应体系的优化，创建快速检测食品过敏原成分的方法。以过敏原小麦成分检测为例，选择GAG56D基因高特异性片段，设计4条LAMP引物及2条环引物，在65℃中实现恒温扩增1h，使用SYBR GreenI作为荧光染料，在反应结束之后，阴性结果为橙色，阳性结果为绿色。此方法的灵敏度为0.01%，实现50份样品的检测，分别为29份小麦原料样品、23份小麦加工制品、7份没有小麦成分的样品，结果和实时荧光定量PCR相同，符合率为100%，能够缩短检测的时间，操作较为简单[10]。
4 结语
环介导等温扩增技术是一种较为便捷、快速的核酸检测方法，和实时荧光定量PCR方法及常规PCR方法相同，都是食品安全检测的主要工具。目前，我国已经具有基于环介导等温扩增技术的食品检测标准，比如出口食品中转基因成分环介导等温扩增检测方法及进出口食品中致病菌环介导等温扩增检测方法。与传统PCR方法对比，LAMP的主要优势为反应时间较短，不需要昂贵的PCR仪器，能够实现单一样品多种靶基因的同时检测等。LAMP技术还可以进一步完善及优化，比如多种LAMP设计、与芯片技术结合，从而实现灵敏、特异、快速及高通量的目的，成为检测核酸、微病菌及微生物的主要工具，被广泛应用到卫生防疫、食品安全检测等领域，具有广阔的前景。
参考文献
[1]李会丽.环介导等温扩增技术在食品检测中的应用[J].职业与健康，2014，30（14）：2022-2023.
[2]冯唐锴，江雪，韩文华.环介导等温扩增技术在食品检测中的应用[J].食品研究与开发，2015，36（17）：179-182.
[3]何晓华，顿玉慧，卢力，等.环介导等温扩增技术在肠杆菌科致病菌检测中的研究进展[J].食品科学，2014，35（19）：312-317.
[4]张明哲，陈曦，徐俊锋，等.环介导等温扩增技术在转基因水稻Bt63检测中的应用[J].生物技术通报，2014（2）：69-74.
[5]杨丽霞，邱华丽，蒋成，等.可视化环介导等温扩增技术检测鸡鸭源性成分[J].食品安全质量检测学报，2017，8（2）：624-628.
[6]庞心怡，满朝新，赵玥明，等.环介导等温扩增技术快速检测肉中沙门氏菌[J].中国食物与营养，2015，21（8）：12-15.
[7]赵玥明，满朝新，曲艳艳，等.环介导等温扩增技术快速检测肉中金黄色葡萄球菌[J].中国食物与营养，2016，22（1）：57-61.
[8]杨粤，付博宇，张蕴哲，等.环介导等温扩增检测技术的应用与方法改进[J].食品安全质量检测学报，2016，7（4）：1526-1530.
[9]冀国桢，李刚，赵建宁，等.环介导等温扩增技术在转基因成分检测中的应用[J].食品科学，2016，37（11）：255-261.
[10]邢宇俊，吴季荣，徐剑宏，等.环介导等温扩增技术检测转基因组分的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2014（3）：853-860.
（责编：徐世红）
关键词：环介导等温扩增；食品检测；微生物检测
中图分类号 TS207.3 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）21-0041-03
环介导等温扩增技术（LAMP）为Notomi等人所发现的恒温核酸扩增技术，与传统PCR技术相比，其避免了不必要的环节，节约时间，并且具有较高的灵敏度。LAMP技术利用2对特异性引物实现目的序列6个区域的退火杂交，通过Bst DNA聚合酶催化作用，基于恒温条件中温育30～60min，能够实现目标序列批量的扩增。其反应结果能够直接通过肉眼观察是否具有白色焦磷酸镁沉淀，从而进行判断，还能够添加羟基酚蓝、钙黄绿素等荧光染料实现显色观察。常规PCR与实时定量PCR技术是现在使用较为广泛的分子生物学检测方法，但是因为PCR方法操作过程较为繁琐，并且时间較长，对于仪器设备具有较高的要求，不能够在临床快速检测中使用。但是LAMP技术具有较强的特异性，并且具有较高的灵敏度，不需要昂贵仪器，能够在现场病原体及基层检测中使用。目前，该方法被逐渐改进，也被广泛应用到食品微生物检测过程中。
1 LAMP的技术原理
双链DNA在65℃左右为动态平衡的状态，任何引物和双链DNA互补的部位实现碱基互补配对延伸的过程中，另外1条链就会脱落成为单链，LAMP的方法就是通过DNA此种特点技术实现的。
LAMP方法4个引物指的是针对靶基因中的6个区域实现设计的，此6个区域在3′端F3c区段、F2c区段、F1c区段及处于5′端的B1区段、B2区段及B3区段（图1）。LAMP方法的2条内引物FIP与BIP，FIP包括TTTT连接子、F1c序列及F2序列，BIP包括TTTT连接子、B1c序列、B2序列，2条外引物分别为F3和B3序列。LAMP引物设计不仅要避免引物二聚体的形成、引物自身的互补及3，端的发夹结构，对于引物距离也具有一定的要求。F3和F2之间、B2和B3之间距离为0～20bp，引物中环的距离为40～60bp，LAMP反应扩增区域距离为120～180bp[1]。
LAMP等温扩增技术反应体系一般为25μL，包括引物、模板DNA、dNTPs、BstDNA聚合酶及缓冲液。其中的内引物浓度为0.8～2.0μmol/L，外引物的浓度为0.2～0.8μmol/L，镁离子的浓度为2～10mmol/L。不同物质混合之后，放到60～65℃中保温60～90min，80℃灭活10min，产物通过2.0%琼脂糖凝胶电泳分析，并且肉眼观察反应体系浊度变化[2]。
2 环介导等温扩增技术的优势
2.1 特异性较高 由于LAMP技术设计的4对引物是将病原微生物特异性基因靶核酸序列作为基础，能够有效识别靶基因中的6个特异序列，将其进行结合能够导致扩增效应的发生，反应混合物中非靶基因DNA并不会被其影响。LAMP一般能够检测RCR中1/100拷贝数，具有较高的检测灵敏度，因此LAMP的灵敏度及特异性较高。
2.2 反应时间较短 LAMP是在恒温条件下扩增反应，在1h之内能够将全部反应实现，与PCR反应过程中的温度循环并不相同，假如将2条环引物添加到反应体系中，能够缩短反应时间。对比PCR方法，LAMP方法反应时间比较短，使用非常简单，能够满足快速检测的需求[3]。
2.3 检测方便 通过LAMP实现多种茎状DNA的合成，并且产生大量焦磷酸根离子，将镁离子添加到反应溶液中，能够产生白色焦磷酸镁沉淀，利用肉眼就能对其进行观察，或者使用浊度仪在400nm光中对浊度进行检测，就能够对是否扩增进行检测。PCR虽然能够产生焦磷酸盐或者磷酸盐离子，但是产生的量比较少，无法用于检测。LAMP方法也能够通过生成的焦磷酸镁沉淀量结合DNA生成量的线形关系，对DNA进行定性及定量分析。
2.4 操作较为简单 LAMP反应扩增实现是在等温条件中进行，对比PCR较为简单，只需要实验室具有水浴锅，直接检测反应后的产物就能够判断，不需要复杂设备和试剂，在快速检测及现场检测过程中非常有利[4]。
3 环介导等温扩增技术在食物检测中的使用
3.1 在食源致病菌中的检测 LAMP技术在食源致病菌检测过程中应用较多，并且方法较为成熟。LAMP在大肠杆菌研究中使用较为广泛并且成熟，对于不同类型的大肠杆菌使用不同的靶序列设计引物实现专门检测。研究人员通过大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因保守区实现引物的设计，创建LAMP技术快速检测的方法。针对肉类中的大肠杆菌O157：H7，利用其特异性抗原rfbE基因和鞭毛H7特异性抗原flic基因成为靶序列，实现环引物改良LAMP引物序列的设计，从而创建快速检测方法，肉眼就能够观察结果，从而实现单管的同时检测。
多类别沙门氏菌能够导致人畜局部的感染性化脓，从而出现败血症或者死亡。研究人员通过沙门氏菌高度保守fimY基因靶序列实现引物设计，创建LAMP反应体系。阳性菌株检测率为100%，此技术对检测牛奶沙门氏菌污染具有一定的灵敏度[5]。
葡萄球菌属于革兰式阳性球菌，部分致病并且为较常见的化脓性球菌。最为常见的就是金黄色葡萄球菌，此菌种LAMP检测方法比较多，可以通过创建LAMP方法检测猪血中金黄色葡萄球菌。凝固酶阳性葡萄球菌会导致人局部化脓性感染，还会出现败血症、肺炎等疾病。针对此菌种特有coa基因实现引物的设计，能够创建具有良好特异性及较高检出率的LAMP检测方法。 阪崎肠杆菌会导致新生儿小肠结肠炎、脑膜炎等，并且具有较高的感染率及死亡率。通过阪崎肠杆菌16S-23SrDNA间区序列实现特异性引物的设计，并且创建LAMP检测方法，此种方法在实现奶粉样品阪崎肠杆菌检测过程中的低限为1.2CFU/100g。
副溶血性孤菌是在各种水产品寄生的有害菌，也是导致人类食物中毒的主要病原体。结合LAMP技术和叠氮溴化乙锭染色，通过副溶血性孤菌tlh基因成为靶序列实现特异性引物的设计，创建快速食品副溶血性孤菌检测的方法，通过此种方法还能够检测克氏蟞虾寄生副溶血性孤菌，其结果和国家标准的检测方法相同[6]。
3.2 在食源致病病毒中的检测 食源病毒主要在家畜、家禽、蔬菜、水产等活体中寄存，会导致活体大量死亡，从而造成经济损失。禽流感病毒（AIV）会导致出现禽类流感，给养禽业造成较大的损失。此病毒为RNA病毒，主要包括16个HA亚型，此亚型能够对人造成感染，或者还会导致死亡。LAMP技术对禽流感病毒检测过程中具有较高的灵敏度，能够在大规模农场家禽感染检测过程中使用。对于H1N1亚型禽流感病毒HA基因及M基因实现2组特异性引物的设计，并且实现LAMP单管快速检测方法的创建，反应结果利用浊度实现判断，最低能够对10拷贝/管病毒颗粒进行检测[7]。
除了禽流感之外，LAMP還能够在其他禽类病毒检测过程中使用。鹅副黏病毒会导致鹅消化道传染病，通过此病毒F基因实现引物设计，创建LAMP检测方法。禽呼肠孤病毒会导致禽类肝炎、心包炎等疾病，对于此病毒p10基因实现引物设计，创建使用钙黄绿色荧光显示结果的LAMP检测。
3.3 在转基因食品中的检测 目前对于是否推广使用转基因食品具有一定的争议，实现灵敏转基因食品检测方法的创建尤为重要。LAMP技术在此方面能够充分发挥作用，其检测转基因食物靶基因为被转化基因的自身，也就是转基因最常使用的启动子。大部分转基因食物中都具有CaMV-35S启动子，所以对其启动子检测就能够判断此食物是否属于转基因。对于人工改造光源cry1Ac基因实现LAMP特意引物的设计，并且通过荧光杏色使用转基因水稻的检测[8]。
3.4 在食品过敏原成分的检测 食物过敏是导致肠道、皮肤和呼吸道等多种急性疾病的主要原因，目前对过敏症的治疗主要方法就是避免食用具有过敏原的食物，要求生产商在食物标签中将导致过敏成分进行标识，避免消费者在不知情的情况下误食导致过敏。目前，国内外常用检测食品过敏原成分方法主要包括核酸检测及免疫学检测[9]。核酸检测具有快速、灵敏及精准的优势，通过深加工的食品，核酸成分还是具有一定稳定性，所以其成为主要检测基础。将8种食物过敏原中的典型产品作为研究对象，对实现具有较高特异性的过敏原基因片段进行筛选，将其作为检测对象，实现LAMP引物的设计，并且实现反应体系的优化，创建快速检测食品过敏原成分的方法。以过敏原小麦成分检测为例，选择GAG56D基因高特异性片段，设计4条LAMP引物及2条环引物，在65℃中实现恒温扩增1h，使用SYBR GreenI作为荧光染料，在反应结束之后，阴性结果为橙色，阳性结果为绿色。此方法的灵敏度为0.01%，实现50份样品的检测，分别为29份小麦原料样品、23份小麦加工制品、7份没有小麦成分的样品，结果和实时荧光定量PCR相同，符合率为100%，能够缩短检测的时间，操作较为简单[10]。
4 结语
环介导等温扩增技术是一种较为便捷、快速的核酸检测方法，和实时荧光定量PCR方法及常规PCR方法相同，都是食品安全检测的主要工具。目前，我国已经具有基于环介导等温扩增技术的食品检测标准，比如出口食品中转基因成分环介导等温扩增检测方法及进出口食品中致病菌环介导等温扩增检测方法。与传统PCR方法对比，LAMP的主要优势为反应时间较短，不需要昂贵的PCR仪器，能够实现单一样品多种靶基因的同时检测等。LAMP技术还可以进一步完善及优化，比如多种LAMP设计、与芯片技术结合，从而实现灵敏、特异、快速及高通量的目的，成为检测核酸、微病菌及微生物的主要工具，被广泛应用到卫生防疫、食品安全检测等领域，具有广阔的前景。
参考文献
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[5]杨丽霞，邱华丽，蒋成，等.可视化环介导等温扩增技术检测鸡鸭源性成分[J].食品安全质量检测学报，2017，8（2）：624-628.
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[7]赵玥明，满朝新，曲艳艳，等.环介导等温扩增技术快速检测肉中金黄色葡萄球菌[J].中国食物与营养，2016，22（1）：57-61.
[8]杨粤，付博宇，张蕴哲，等.环介导等温扩增检测技术的应用与方法改进[J].食品安全质量检测学报，2016，7（4）：1526-1530.
[9]冀国桢，李刚，赵建宁，等.环介导等温扩增技术在转基因成分检测中的应用[J].食品科学，2016，37（11）：255-261.
[10]邢宇俊，吴季荣，徐剑宏，等.环介导等温扩增技术检测转基因组分的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2014（3）：853-860.
（责编：徐世红）