目的:在人类早期胚胎发育过程中,具有自我更新能力的生殖干细胞逐渐失去分裂能力并最终停滞在 G0/G1期.但是,这个转化过程的具体发生时问和发生机理并不十分清楚.因此,研究这个复杂过程首要前提是建立合适的体外培养体系。方法:本实验收集了12～28周流产男性的睾丸,利用机械和酶联合消化的方法,将含有生殖干细胞的单细胞悬液种植在经丝裂酶素处理后的人胚胎成纤维细胞(hEF)饲养层上,并添加白血病抑制因子(LIF)和碱性成纤维细胞因子(bFGF) 维持生殖干细胞的其自我更新能力。同时,Oct-4和碱性磷酸酶(AKP)染色被用来检测生殖细胞的干细胞活性并评价其未分化/分化状态。结果:在本次实验中,我们发现18周之前的生殖干细胞能够在饲养层上形成克隆并且呈明显 Oct-4和 AKP 阳性.这些克隆能在体外培养维持3周左右并逐渐消失.但是,18周之后的生殖干细胞在同样的培养环境中则大量凋亡或者呈成纤维样改变.实验中未观测到克隆形成.而且,这些生殖干细胞经 Oct-4和 AKP 检测结果呈阴性.结论:生殖干细胞在体内可能已经产生分化并且具有时间依赖性.在18周以前的生殖细胞具有明显的干细胞活性,而18 周以后的生殖细胞则失去了干细胞特征并停止分裂。目前的培养体系能够促进具有干细胞活性的生殖细胞形成克隆,但不能激活已经进入分裂停滞期的生殖干细胞。