研究背景和目的在全球,癌症是疾病中导致人类死亡的首要原因。肺癌位居癌症相关死亡的首位,尤其是非小细胞肺癌,约占所有肺癌的85%。目前,肺癌的预后仍不容乐观,I期非小细胞肺癌的五年生存率保持在50-60%,II期为30-40%,而III期仅为15-20%,IV期不足5%。因而探讨新的治疗手段一直是肺癌研究领域的热点。免疫治疗在肿瘤治疗领域显示了巨大潜力,以免疫检查点阻断剂(immune checkpoint blockade,ICB)和嵌合抗原受体 T 细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)为代表的免疫治疗方法,在肿瘤治疗中取得了良好的疗效。然而,免疫治疗的持续应答反应仅发生在少部分患者身上。研究数据表明仅有30%的肺癌患者能够从ICB治疗中受益,因而探讨影响免疫治疗疗效的因素迫在眉睫。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是目前研究的热点,其在抑制或增强免疫应答中发挥着重要的作用。本研究旨在着重探讨TME中哪些关键因素影响免疫治疗的疗效,以及如何为改善当前的免疫治疗方法提供新的方案。免疫治疗要想成功地控制肿瘤的生长,这一过程需要CD8+T细胞的活化、扩增以及顺利浸润至肿瘤内部,才能实现其抗肿瘤反应。然而,免疫细胞的浸润缺失及效应T细胞的耗竭导致免疫治疗受阻,解决这些问题将从很大程度上提高免疫治疗效果。故寻找合适的促进效应性T细胞浸润的关键分子是至关重要的,同时如何增强TME中的浸润性CD8+ T细胞的功能也是亟待解决的问题。本文主要探讨了多西他赛通过激活Caspase-ROS诱导肿瘤细胞凋亡从而释放大量的HMGB1,HMGB1可以刺激肿瘤细胞进一步分泌CXCL11,从而促进CD8+ T细胞到肿瘤内部的招募;同时TME中的HMGB1可以激活CD8+T细胞内的PI3K-AKT-mTOR信号通路,从而增强其抗肿瘤活性。进一步在体内、外实验中采用CAR-T细胞模型检测多西他赛通过HMGB1增强CAR-T细胞招募及功能。从而为化疗联合免疫治疗提供新的策略和实验依据。第一部分化疗通过趋化因子影响CD8+T细胞在肺癌TME中的分布方法1)RT-PCR分析组织中CD8及T细胞功能性细胞因子(IFN-γ、Granzyme B及Perforin)在基因水平的表达。2)流式分选技术分选获得CD8+ T细胞。3)Transwell实验检测CXCL11对CD8+ T细胞的招募。4)流式细胞术分析肺癌患者肿瘤组织及正常组织CD8+ T细胞的比例及其功能情况。5)免疫荧光技术分析组织中CD8和CXCR3的共定位情况,分析肿瘤浸润性CD8+ T细胞的浸润。6)免疫组化分析CXCL11的表达。结果1)CD8+T细胞及其功能性标志物(IFN-γ、Granzyme B及Perforin)在肿瘤组织中的表达要明显低于正常组织。2)肺癌组织中CXCL11表达明显低于正常组织,而以多西他赛为基础的化疗患者的CXCL11在肿瘤组织内表达明显高于正常组织。3)CD8+ T细胞在以多西他赛为基础的化疗患者肿瘤组织中浸润增加。4)CXCL11影响CD8+ T细胞的招募。小结肺癌中的肿瘤组织多为“冷肿瘤”,而以多西他赛为基础的化疗通过改善趋化因子CXCL11的表达诱导CD8+ T细胞的浸润增加。第二部分HMGB1通过上调CXCL11促进CD8+T细胞招募的机制研究方法1)免疫荧光检测组织中CXCL11与EpCAM的表达。2)ELISA检测多西他赛诱导CXCL11的分泌水平。3)流式细胞术检测肿瘤细胞ROS的表达。4)细胞免疫荧光检测肿瘤细胞HMGB1的表达。5)采用SiRNA干扰HMGB1表达后,RT-PCR检测目的基因的表达。6)利用Western blot验证HMGB1上调CXCL11的关键信号通路。7)裸鼠皮下移植瘤模型分析影响CD8+ T细胞招募的关键因素。结果1)CXCL11主要来源于表达EpCAM的内皮细胞。CXCL11主要由多西他赛诱导肿瘤细胞分泌,而非奥沙利铂。2)筛选多种细胞因子发现多西他赛明显上调HMGB1表达,且具有浓度依赖性。3)多西他赛上调Caspase3与Caspase6表达,给予Caspase抑制剂Z-DEVD-FMK将明显抑制HMGB1的表达。4)多西他赛诱导ROS的释放,并被ROS抑制剂(GSH)和Z-DEVD-FMK所抑制。重组蛋白HMGB1上调ROS的释放,给予GSH抑制ROS的释放。5)HMGB1促进肿瘤细胞分泌CXCL11具有浓度和时间依赖性。HMGB1敲低之后给予多西他赛不能刺激CXCL11的表达上调。HMGB1通过活化NF-κB信号通路从而促进CXCL11的表达上调。6)BALB/c裸鼠实验证明多西他赛通过增加HMGB1及CXCL11表达,从而促进CD8+ T细胞到TME的浸润。小结1)多西他赛主要通过HMGB1介导CXCL11的分泌,沉默HMGB1表达后,多西他赛不能刺激CXCL11的表达上调。HMGB1通过活化NF-κB信号通路上调CXCL11的表达。2)HMGB1主要依赖Caspase3-ROS-HMGB1-ROS的正反馈信号通路被肿瘤细胞所释放。第三部分HMGB1上调CD8+ T细胞的功能及其机制研究方法1)流式细胞术检测HMGB1对CD8+ T细胞功能的影响。2)敲低或过表达HMGB1后,检测其对CD8+ T细胞功能的影响。3)利用Western blot检验HMGB1影响CD8+ T细胞功能的关键信号通路。4)构建敲低或过表达HMGB1裸鼠模型,分析影响CD8+ T细胞功能的关键因素。结果1)HMGB1 增强 CD8+ T 细胞中 CD8+IFN-γ+ T 细胞、CD8+Granzyme B+ T细胞及CD8+ Perforin+ T细胞的比例。2)与敲低HMGB1的肿瘤细胞共孵育降低CD8+T细胞功能,反之,过表达HMGB1后将增强CD8+T细胞功能。3)HMGB1 活化 CD8+T 细胞 PI3K-AKT-mTOR 信号通路。4)敲低HMGB1之后,CD8+T细胞在小鼠体内抗肿瘤能力降低;过表达HMGB1之后,CD8+T细胞在小鼠体内抗肿瘤能力增加。小结HMGB1通过活化CD8+ T细胞内PI3K-AKT-mTOR信号通路从而增强其抗肿瘤功能。第四部分体外及体内实验验证HMGB1对CAR-T细胞招募及功能的影响方法1)构建HER2-CAR的逆转录病毒载体转染CD8+ T细胞,分析HMGB1对HER2-CAR T细胞功能的影响。2)采用Annexin-V/PI双染法检测HMGB1对CD8+ T细胞杀伤肿瘤细胞功能的影响。3)构建稳定肺癌细胞系Sh-HMGB1-A549-Luciferase,小动物活体成像系统连续观察肿瘤生长情况。结果1)HMGB1 明显上调 CAR-T 细胞中 IFN-γ+ CAR-T 细胞及 CD107a+ CAR-T细胞的比例,同时增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。2)与敲低HMGB1的肿瘤细胞共孵育降低CAR-T细胞功能,反之,过表达HMGB1后将增强CAR-T细胞功能。3)敲低HMGB1后降低CAR-T细胞在Balb/c裸鼠体内的抗肿瘤效果。4)小鼠体内实验发现多西他赛增加HMGB1及CXCL11表达,并促进CAR-T细胞到TME的浸润及杀伤功能。小结1)HMGB1增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力,提示其可能成为抗肿瘤免疫治疗中新的刺激因子。2)多西他赛增加HMGB1及CXCL11表达,并促进CAR-T细胞到TME的浸润及杀伤功能,提示多西他赛可以增强免疫治疗的抗肿瘤能力。结论1)多西他赛通过HMGB1上调趋化因子CXCL11的分布从而增强CD8+ T细胞到肿瘤部位的浸润,即实现“冷肿瘤”向“热肿瘤”的转化,从而增强抗肿瘤免疫反应。2)HMGB1能够增强CD8+T细胞的功能,并通过体内、外实验验证HMGB1增强HER2-CAR T细胞对肺癌细胞的杀伤功能。通过将增加HMGB1释放的治疗手段与CAR-T细胞治疗结合起来可能为实体瘤治疗提供新的策略。