论文部分内容阅读
目的：本文拟研究小鼠暴露PFOS后对免疫器官脾脏产生的影响,并采用基因组学方法对其可能的分子机制进行解析.方法：BALB/C小鼠经口暴露于0、5、10mg/kg/day的PFOS共21天,随后进行7天的无暴露恢复处理.分别在7、14、21、28天的时间节点对小鼠处死分别测定观察小鼠体重、脾脏重量.采用组织切片染色和显微镜观察脾脏组织结构变化；针对脾脏总T细胞(CD3+)、辅助T细胞(CD3+CD4+)、杀伤T细胞(CD3+CD8+)、B细胞(CD45R+)和单核细胞(CD11b+)进行流式细胞仪细胞分型分析,确定各类型细胞的组成比例；采用淋巴细胞增殖实验研究PFOS暴露小鼠后其脾脏T细胞和B细胞对有丝分裂原ConA和LPS的反应,以WST-1测定细胞的增殖；随后采用基因芯片方法(Affymetrix Mouse430_2)对10mg/kg/day暴露组小鼠的脾脏进行基因表达谱分析和Pathway分析.基因芯片结果用定量PCR和Western-blot进行验证.结果：10mg/kg/day暴露引起小鼠体重和脾脏指数显著性下降,伴随着脾窦充血扩张、边缘区消失、以及大量巨核细胞的出现.脾脏T淋巴细胞对ConA的刺激反应迟钝,与对照组相比,增殖下降,这种效应从第一周开始出现,在第四周还存在；而B细胞对LPS刺激的反应在第一周迟钝,随后这种效应消失.细胞分型实验发现,总T细胞、辅助T细胞和杀伤T细胞在脾脏细胞中所占百分比随着暴露剂量上升而上升,但是B细胞比例在第一周上升后,效应消退.单核细胞比例在第3周下降,呈剂量-效应关系.基因芯片结果发现,共有1327个基因受到PFOS影响(p＜0.05,fold＞1.5倍),其中239(0.8％)个基因上调表达,1088(3.2％)下调表达.随机挑选的14个基因(Ighg、IGHM、 CA CNA 1A、CAMK IⅣ,CAB39L,CD3G、Milr、THEMIS、APK12、AP3K5、E2Fl、CDC25A、CDK1和CDKN1)的mRNA表达采用QPCR方法进行验证,与芯片结果相一致.在其中Themis、CD3g、CAMK IⅣ的蛋白表达也验证了芯片结果,都呈现激活表达趋势.通过对这些异常表达基因的gene ontology分析发现,24个生物过程(如：cell cycle,MHCII-mediated immunity, lipid and fatty acid transport,steroid metabolism)受到调控,29个细胞功能受到了影响,主要为酶类,如：DNA helicase,ligase,kinase,DNA polymerase.Ingenuity信号通路分析结果表明,共有93个通路受到调控,包括一些重要的涉及淋巴细胞发育和成熟的信号通路,如：B Cell Development和calcium-induced T lymphocyte apoptosis等,同时也涉及凝血系统和脂类等生物大分子的合成与代谢途径(如：Fatty Acid β-oxidation I等).钙调蛋白相关的基因异常表达与大多数的通路均有关系,并且在体外采用纯化巨噬细胞和T细胞进行淋巴增殖实验也发现,这个过程中出现胞内自由钙离子浓度上升,而T细胞增殖下降的现象,提示PFOS可能诱导T细胞无能.结论：本研究在个体、组织、细胞、分子和基因水平系统研究了PFOS对免疫器官脾脏的毒性效应和分子机制,发现PFOS可引起脾脏组织结构和免疫细胞成分及功能的变化,基因芯片结果提示,PFOS通过调控钙调相关蛋白的表达,诱导胞内钙离子浓度上升,从而激活相应的下游信号传导通路,引起一系列的组织病理和细胞的不良效应.