【摘 要】
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目的 外泌体是直径为30～150 nm 的微囊泡,可由各种类型的细胞产生,通过与细胞膜融合将其携带的信息货物(例如蛋白质,脂质和核酸)释放到细胞外环境中.作为一种新型信号分子,外泌体与肿瘤的生长、转移及化疗耐药密切相关.MicroRNAs(miRNAs)是小型的非编码RNAs,它通过抑制目标信使RNAs 的转录发挥作用.miRNAs 在胃癌发生发展中的调控作用使其成为可提供新型诊断及治疗方法 的有
【机 构】
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江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院)
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目的 外泌体是直径为30～150 nm 的微囊泡,可由各种类型的细胞产生,通过与细胞膜融合将其携带的信息货物(例如蛋白质,脂质和核酸)释放到细胞外环境中.作为一种新型信号分子,外泌体与肿瘤的生长、转移及化疗耐药密切相关.MicroRNAs(miRNAs)是小型的非编码RNAs,它通过抑制目标信使RNAs 的转录发挥作用.miRNAs 在胃癌发生发展中的调控作用使其成为可提供新型诊断及治疗方法 的有效工具.本研究中,我们发现108 名胃癌患者的血浆中外泌体含量显著高于108 名健康志愿者,且胃癌细胞的培养上清液中外泌体的含量显著高于人胃粘膜细胞GES-1 的培养上清液.其中,胃癌患者血浆及胃癌细胞培养上清液中Exo-miRNA-15b-3p 的表达量显著高于健康志愿者血浆及GES-1 细胞上清液.本研究旨在探究Exo-miRNA-15b-3p 在胃癌发生发展过程中的功能及其作用机制.方法 我们通过超速离心分别从血浆及细胞培养上清液中成功分离外泌体；使用透射电子显微镜和Nanosight 分析确定外泌体的形态及大小；通过Western blot 检测外泌体的特殊蛋白标记物(CD9,CD63,TSG101).使用qRT-PCR 检测Exo-miRNA-15b-3p 的表达.通过荧光共聚焦显微镜观察到被PKH-67 标记的来源于胃癌细胞BGC-823 的Exo-Cy3-miRNA-15b-3p-mimics 可以被受体细胞(SGC-7901 及GES-1)摄取及内化.通过CCK8、克隆形成、EDU、Transwell、细胞侵袭实验、细胞凋亡的流式细胞术分析,TUNEL,Western blot 检测凋亡相关蛋白(BAX,BCL-2,BCL-XL)的表达量以评估Exo-miRNA-15b-3p 在体外的功能.构建BALB/c nu/nu 裸鼠肿瘤模型以评估体内肿瘤的生长、转移、侵袭及凋亡情况.通过双荧光素酶报告基因检测验证miRNA-15b-3p 与DYNLT1 的靶向作用.通过qRT-PCR,Western blot 和免疫组化评估DYNLT1 的表达.通过Western blot 检测Cleaved-Caspase-3 及Cleaved-Caspase-9 的表达量以探究信号通路.结果 胃癌细胞BGC-823 分泌的外泌体通过内吞作用内化,介导miRNA-15b-3p 转移至受体细胞SGC-7901 及GES-1 内.Exo-miRNA-15b-3p 在体外和体内均增强了肿瘤的增殖、迁移和侵袭,抑制了肿瘤的凋亡.血浆Exo-miRNA-15b-3p 的ROC 曲线下面积(AUC)为0.80,且高表达Exo-miRNA-15b-3p 的患者生存期及预后显著差于低表达人群.因此,Exo-miRNA-15b-3p 可能与胃癌的发生和发展密切相关且具有一定的临床诊疗价值.双荧光素酶报告基因检测结果 表明miRNA-15b-3p 通过直接靶向其3-UTR 来抑制DYNLT1 的表达,进而通过Caspase-9/Caspase-3 信号通路抑制凋亡,促进肿瘤的发生与发展.在胃癌细胞、108 名胃癌患者的肿瘤组织及使用Exo-miR-15b-3p 处理的裸鼠肿瘤组织中,DYNLT1 的表达水平显着降低,Caspase-9/Caspase-3 信号通路被抑制.结论 我们的研究首次表明Exo-miRNA-15b-3p 通过在体外和体内直接靶向DYNLT1 的启动子进而抑制Caspase-9/Caspase-3 信号通路来促进胃癌的生长、转移及侵袭,抑制肿瘤的凋亡.此外,血浆Exo-miRNA-15b-3p 可作为胃癌诊断及预后的潜在生物学标志物,为胃癌的诊治提供新思路.
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