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目的:分别采用切向流超滤纯化和PEG-6000沉淀纯化两种方法用于鸡新城疫灭活抗原纯化,通过HA效价、蛋白含量、甲醛残留量、抗原保存期等指标检测比较纯化效果,为进一步在生产中推广应用提供科学依据.
方法:(1)超滤纯化将抗原以4000rpm,离心25min,取上清,用PBS进行5倍稀释,采用300KD超滤膜包进行切向流超滤纯化,至回收液达到稀释前剂量,完成第一次超滤纯化,按照此方法将抗原进行两次超滤纯化;对抗原纯化前后样品及废液样品分别进行HA效价、蛋白含量、甲醛残留量等指标检测及抗原保存期试验.(2) PEG-6000沉淀纯化将抗原以4000rpm,离心25min,取上清,分别加入8％( WN )PEG-6000和Imol/L NaCI,充分溶解,置于37℃振荡25min,常温静置2h,以lOOOOrpm,离心25min,弃上清(上清液即为废液);在沉淀抗原中按照离心前剂量加入PBS,振荡溶解,4℃保存备用;对抗原纯化前后样品及废液样品分别进行HA效价、蛋白含量、甲醛残留量等指标检测及抗原保存期试验.
结果:(1)超滤纯化HA效价检测结果:纯化前、纯化后样品HA均为9log2,废液HA为0;蛋白含量检测及杂蛋白去除率计算结果:纯化前、纯化一次、纯化二次样品蛋白含量分别为78.88mg/ml、11.28mg/ml、3.74mg/ml,纯化一次、纯化二次样品杂蛋白去除率分别为85.70％、95.26％;甲醛含量检测结果:纯化前、纯化一次、纯化二次样品甲醛含量分别为0.212％、0.034％、0.01l％;抗原2-8℃保存试验结果:分别于纯化后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月检测纯化抗原样品HA效价,结果均为9log2.(2)PEG-6000沉淀纯化HA效价检测结果:纯化前、纯化后样品HA均为9log2,废液HA为0;蛋白含量检测及杂蛋白去除率计算结果:纯化前、纯化后样品蛋白含量分别为78.88mg/ml、1.60mg/ml,杂蛋白去除率为97.97％;甲醛含量检测结果:纯化前、纯化后甲醛含量分别为0.212％、0.013％;抗原2-8℃保存试验结果:分别于纯化后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月检测纯化抗原样品HA效价,结果均为9log2.
结论:(l)两种方法都可使纯化抗原蛋白含量达到3.7mg/ml以下,杂蛋白去除率达到95％以上,纯化前后新城疫抗原的HA效价未发生变化.配制疫苗后,疫苗蛋白含量有可能可以达到微克水平.参照农业部颁布的口蹄疫疫苗标准,蛋白含量基本可以达到要求.(2)化学沉淀法操作简单,杂蛋白去除率优于切向流超滤纯化.(3)纯化抗原甲醛含量极低,在18个月观察期内,抗原样品HA效价维持不变,有效保证了疫苗半成品的稳定性.