【摘 要】
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目的 构建双歧杆菌中启动子活性报告载体,检测不同启动子作用下报告基因的表达状况,以筛选出双歧杆菌质粒的高效启动子、实现治疗基因在双歧杆菌中的高效表达,为深入开展
【机 构】
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北京大学基础医学院放射医学教研室,北京 100191
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目的 构建双歧杆菌中启动子活性报告载体,检测不同启动子作用下报告基因的表达状况,以筛选出双歧杆菌质粒的高效启动子、实现治疗基因在双歧杆菌中的高效表达,为深入开展以双歧杆菌为基因递送载体的肿瘤基因-放射治疗研究奠定基础.方法 依据Genbank中公布的基因序列信息,设计特异引物,使用PCR方法扩增获得噬菌体prp1启动子、青春双歧杆菌recA启动子、长双歧杆菌hup启动子和报告基因——带有组氨酸标签的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因.采用BamHI和KpnI双酶切、PstI和BamHI双酶切,将报告基因CD和启动子prp1、recA、hup的目的片段插入我室自行构建的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pCMB1的多克隆区,构建重组质粒报告载体.使用电穿孔方法将含有不同启动子的报告载体以及对照质粒pCMB1-CD转化长双歧杆菌NCC 2705.采用实时定量PCR(Quantitive-real-time PCR)、SDS-PAGE和Western blot方法检测不同启动子作用下报告基因CD在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况.结果以大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒pCMB1为构架、以带组氨酸标签的CD为报告基因成功构建了三组启动子活性报告载体pCMB 1-prp1-CD,pCMB 1-recA-CD和pCMB 1-hup-CD,经酶切和DNA测序鉴定正确无误.构建的上述三组启动子活性报告载体成功转化了长双歧杆菌NCC 2705并在其中稳定复制.启动子活性检测结果表明,三组启动子活性报告载体转化长双歧杆菌NCC 2705后,均可在mRNA转录水平和蛋白质水平表达报告基因CD.其表达量以pCMB 1-recA-CD质粒转化菌株最高,pCMB 1-prp1-CD质粒转化菌株次之,pCMB 1-hup-CD质粒转化菌株最低. 结论双歧杆菌质粒启动子活性以recA最高,prp1次之,hup最低.以大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒pCMB1为构架、以CD为报告基因构建获得的启动子活性报告载体可作为双歧杆菌中不同启动子活性检测和不同启动子序列功能分析的工具.
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