研究背景乳腺癌是女性最高发的恶性肿瘤,发病率占女性癌症29%,且年轻患者比例逐年上升。其死亡率占女性癌症15%,是第二高死亡率的女性肿瘤,对女性的生理和心理健康有着重大的威胁。随着生物医学研究的进步,近年来,除通过手术治疗切除肿瘤组织以外,乳腺癌的综合治疗已经形成规范化治疗乳腺癌的临床共识,包括手术治疗、放疗、化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗和中医药治疗等等。其中,化疗对于乳腺癌的综合治疗有着重要的意义。术前的新辅助化疗可以缩小癌症的原发病灶,增加乳腺癌手术治疗和保乳机会;术后辅助化疗可以预防癌症的复发和转移,晚期乳腺癌的化疗亦可起到延长患者的生存期,提高患者的生活质量,甚至长期带瘤生存。阿霉素是一种经典的乳腺癌化疗药物,有临床研究证实,阿霉素单药使用即可对早期乳腺癌达到良好的治疗效果,其与其他化疗药物及靶向药物联合使用时可以增加患者获益,但阿霉素类药物在乳腺癌化疗的基石地位仍未被撼动。在阿霉素的临床应用过程中,不可避免存在化疗药物耐药的共同问题,而化疗药物耐药与肿瘤的进展和复发有着密切的联系,是导致患者临床预后不佳的重要原因之一。目前认为,乳腺癌的化疗耐药与肿瘤细胞凋亡,肿瘤细胞干性增强,肿瘤微环境,DNA损伤修复等多种因素相关。但其具体机制尚未完全阐明,探明其化疗耐药的机制对于乳腺癌患者的治疗有着重要的意义。蛋白质精氨酸甲基转移酶5(Protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)归属于蛋白质精氨酸甲基转移酶(Protein arginine methyltransferases,PRMTs)家族,PRMTs可以催化甲基基团转移到蛋白质精氨酸的氨基上,依据其催化精氨酸的方式,PRMTs主要可以分为两大类,即I型PRMTs和II型PRMTs。作为II型PRMTs最早被鉴定的成员,PRMT5受到了国内外众多研究人员的关注,近年来,大量研究结果表明,PRMT5是一个潜在的致癌基因,其表达的过度增加或功能的异常激活可以促进包括乳腺癌在内的多个肿瘤的发生及发展。且其在调控肿瘤细胞对放疗的耐受性中起到了重要的作用。肿瘤干细胞(CSCs)是一类具有高自我更新和高分化能力的肿瘤细胞,其在肿瘤的生长和发展以及肿瘤的复发中发挥着很重要的作用。最近的研究结果表明肿瘤干细胞在多种肿瘤的化疗药物耐药中发挥了重要的功能,且阿霉素耐药的乳腺癌细胞MCF-7/ADR中肿瘤细胞的干性水平增加。同时有文献提示PRMT5对于小鼠的胚胎干细胞和神经干细胞的干性调控有着重要的意义。然而PRMT5在肿瘤细胞干性调控中的作用尚未阐明。本课题组对GEO数据库的分析和预实验结果表明:化疗药物阿霉素对乳腺癌细胞的作用可以显著升高细胞内PRMT5的表达水平。且与正常的乳腺癌细胞相比,阿霉素耐药的乳腺癌细胞内PRMT5的表达明显增加。但是其表达水平的升高对乳腺癌细胞阿霉素耐药的影响以及潜在的分子机制尚未明确。研究方法和结果1.PRMT5在乳腺癌细胞株和临床乳腺癌样本中表达状态及对乳腺癌细胞生物学行为影响的研究(1)RT-q PCR和Western Blot检测了PRMT5在人乳腺正常上皮细胞MCF10A和五株人乳腺癌细胞系中的表达水平。(2)用Western Blot和免疫组织化学的方法检测了PRMT5在临床乳腺癌患者的肿瘤组织样本和癌旁正常组织样本中的表达水平。(3)使用慢病毒感染的方法构建了MDA-MB-231和MCF-7过表达PRMT5的细胞株。(4)用MTT实验分别检测MDA-MB-231和MCF-7过表达PRMT5后细胞增殖活性的变化。(5)用Transwell实验检测MDA-MB-231过表达PRMT5后细胞迁移能力的变化。结果显示PRMT5在人乳腺癌细胞株和人乳腺肿瘤组织中表达明显升高,PRMT5过表达后促进了乳腺癌细胞增殖、迁移能力。表明PRMT5在乳腺癌中可能发挥致癌基因的功能。2.PRMT5促进乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性(1)通过GEO数据库,对PRMT5在亲本细胞MCF-7和阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR中的表达水平进行分析。(2)用Western Blot检测了PRMT5在亲本细胞MCF-7和阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR中的表达水平。(3)使用慢病毒感染的方法敲减了MCF-7/ADR细胞中的PRMT5。(4)用MTT实验检测MCF-7/ADR敲减PRMT5后对阿霉素耐药性的变化。(5)用Western Blot检测MCF-7/ADR敲减PRMT5后细胞凋亡相关分子表达的变化。(6)用TUNEL实验检测MCF-7/ADR敲减PRMT5后细胞凋亡水平的变化。(7)用MTT实验分别检测MDA-MB-231和MCF-7细胞过表达PRMT5后对阿霉素耐药性的变化。(8)用Western Blot分别检测MDA-MB-231和MCF-7细胞过表达PRMT5后细胞凋亡相关分子表达的变化。(9)用TUNEL实验分别检测MDA-MB-231和MCF-7细胞过表达PRMT5后细胞凋亡水平的变化。结果显示,相较于亲本细胞MCF-7,MCF-7/ADR细胞中的PRMT5水平明显增高。PRMT5敲减后MCF-7/ADR对阿霉素的耐药性明显降低。PRMT5敲减后细胞的凋亡相关分子Bcl-2表达减少,而Bax表达增加,表明细胞凋亡水平增加。敲减PRMT5后凋亡细胞数量显著增多。而在过表达PRMT5后乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性增加。过表达PRMT5后细胞内Bcl-2表达增加而Bax表达降低,表明细胞的凋亡水平降低。过表达PRMT5后凋亡细胞的数量减少。由此可见,PRMT5促进了乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性。3.PRMT5通过调控乳腺癌细胞的干性来促进乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性PRMT5可以促进乳腺癌细胞对化疗药物的耐药性,且既往研究表明PRMT5可以促进胚胎和神经干细胞的干性维持,而乳腺癌细胞干性的增加会导致其对化疗药物的耐药性。因此:使用乳腺球形成实验和流式细胞仪分别检测MDA-MB-231和MCF-7细胞过表达PRMT5及MCF-7/ADR敲减PRMT5后细胞干性的变化。结果表明,过表达PRMT5可以增强乳腺癌细胞的干性,敲减PRMT5可以降低乳腺癌细胞的干性,PRMT5通过调控乳腺癌细胞的干性来促进乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性。4.PRMT5调控乳腺癌细胞干性来促进乳腺癌细胞对阿霉素耐药性的机制初探(1)用Western Blot检测MDA-MB-231和MCF-7细胞过表达PRMT5及MCF-7/ADR敲减PRMT5与否干性相关调控分子C-MYC,OCT4/A和KLF4表达的变化。(2)用Western Blot检测乳腺癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织的C-MYC,OCT4/A和KLF4的表达并与PRMT5做相关性分析。(3)使用慢病毒感染方法构建MDA-MB-231和MCF-7过表达PRMT5的甲基化失活突变体PRMT5(R368A)的细胞株。(4)用RT-q PCR分别检测MDA-MB-231和MCF-7亲本、过表达PRMT5和PRMT5(R368A)时C-MYC,OCT4/A和KLF4分子m RNA水平的变化。(5)用Western Blot分别检测MDA-MB-231和MCF-7过表达PRMT5和PRMT5(R368A)时C-MYC,OCT4/A和KLF4表达的变化。(6)用乳腺球形成实验和流式细胞仪分别检测MDA-MB-231和MCF-7细胞过表达PRMT5(R368A)时的细胞干性。(7)用MTT方法分别检测MDA-MB-231和MCF-7亲本、过表达PRMT5和PRMT5(R368A)对阿霉素耐药性的差异。(8)用Western Blot方法检测MDA-MB-231和MCF-7亲本、过表达PRMT5和PRMT5(R368A)凋亡相关分子表达的差异。(9)TUNEL实验检测MDA-MB-231和MCF-7细胞过表达PRMT5(R368A)时的细胞凋亡情况。结果表明,过表达PRMT5可以升高细胞内干性相关调控分子C-MYC,OCT4/A和KLF4分子蛋白水平的表达,而在m RNA水平仅仅发现OCT4/A和C-MYC的表达升高。乳腺癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织的PRMT5蛋白表达水平与C-MYC、OCT4/A和KLF4的蛋白表达水平具有相关性。PRMT5调控细胞干性来促进乳腺癌细胞对阿霉素耐药性依赖其甲基化能力,过表达PRMT5(R368A)的细胞其干性及对阿霉素的耐药性与亲本细胞无明显差异。结论通过本课题的研究,我们发现PRMT5在乳腺癌细胞株和乳腺癌患者的肿瘤组织中有异常的高表达,是一个明确的致癌基因。同时,在阿霉素耐药的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中PRMT5的表达明显升高。证明了PRMT5可以通过调控乳腺癌细胞干性来促进乳腺癌对化疗药物阿霉素的耐药性,抑制PRMT5可以降低乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性。综上所述,本研究明确了PRMT5在乳腺癌耐阿霉素中的作用,进一步阐明了PRMT5对乳腺癌细胞干性的调控,为靶向抑制PRMT5在乳腺癌治疗中的应用提供了有力的证据。