背景和目的:心血管疾病是一类心脏与血管的疾患,已成为全球头号杀手。血管内皮损伤是心血管疾病的一个常见的病理改变,与其发生发展密切相关。因此,内皮损伤的修复在心血管疾病的防治中起着十分重要的作用。内皮细胞功能紊乱是血管内皮损伤的基础,内皮细胞的正常功能依靠多种生长因子以及干祖细胞的分化更新得以维持。大量研究表明,定植于血管外膜的血管祖细胞(vascular progenitor cells,VPCs)对血管内皮损伤的修复起着重要的作用。当血管壁内皮细胞损伤时,VPCs可以迁徙到内膜并分化成有功能的内皮细胞,替代已损伤的细胞,从而发挥修复损伤的功能。众所周知,真核生物的一大特点即基因调控的复杂性。一个基因通过可变剪接可以产生多种mRNA,进而翻译成功能不尽相同甚至相反的蛋白。近来有文献报道,同一个mRNA可以于不同起始密码子ATG或者CTG(约占15%)起始翻译。换言之,一个mRNA可以翻译产生不同的蛋白,这就大大增加了蛋白多样性。组蛋白乙酰转移酶(HDACs)是一类可以将组蛋白赖氨酸上ε-N-乙酰基(O=C-CH3)水解的酶,使得DNA缠绕组蛋白更加紧密。哺乳动物的HDACs可分为4种亚型,HDAC7是Ⅱ型HDACs家族中的一员,在胚胎发育早期特异表达在血管内膜,对保持血管完整起到了重要的作用。通过可变剪接,HDAC7 mRNA在人和小鼠中分别有4和8种异构体。小鼠HDAC7 mRNA的一种转录异构体HDAC7-tv2,在它的主开放阅读框架之前还有一个短开放阅读框架(sORF),编码7个氨基酸的小肽(7A)。本研究探讨此sORF是否可以翻译出7个氨基酸的小肽7A。并观察7A在血管生成及血管损伤修复中的作用,探讨其可能的作用机制。方法:1.VEGF在HDAC7 mRNA选择性翻译中的作用。由于7A只有7个氨基酸所以很难用传统方法检测。因此,我们构建了一个包含HDAC7 mRNA主阅读框架前5’端全序列的人工载体pShuttle2-HD7FH。在这个人工载体中,我们在sORF的第一个终止子前插入一个Flag标签,用于检测sORF的翻译情况。同理,在主阅读框架225aa处插入一个HA标签,用于检测载体是否表达HDAC7蛋白。将此质粒载体包装成病毒Ad-HDAC7FH,并转染VPCs,荧光双染检测FLAG和HA。ELISA检测VEGF对FLAG/HA比例的影响。2.VEGF对7aa-小分子多肽磷酸化的影响。2.1 7A(MHSPGAD)中含有一个丝氨酸,是可被磷酸化修饰的氨基酸。为了检测7A中的丝氨酸是否被磷酸化,我们首先做了 pull down沉淀实验,将抗FLAG的磁珠与感染Ad-HDAC7FH的VPCs细胞裂解液孵育,然后沉淀。而后用ELISA检测磁珠的磷酸化情况。2.2为了确认7A被磷酸化的上游激酶,我们将多肽结合蛋白做了蛋白质谱,并且重点分析了 VEGF处理下磷酸化的激酶。接下来WB验证结果。最后,我们用SiRNA抑制了这个激酶,再检测7A磷酸化的情况。3.磷酸化的7A(7Ap)对14-3-3 γ蛋白的影响为了验证7Ap是否直接参与14-3-3γ蛋白的磷酸化,我们将生物素标记的7Ap(Bio-7Ap)与商品化的重组蛋白14-3-3γ在37’C孵育半小时,用亲和素磁珠将Bio-7Ap和14-3-3γ拉下来,并洗脱。ELISA检测亲和素磁珠磷酸化情况,WB检测14-3-3γ磷酸化情况。此外,我们还用免疫荧光染色观察了 7Ap对VPCs中14-3-3 γ和磷酸化14-3-3γ的影响。4.7A对VPCs自我更新及迁移的影响单个细胞集落形成实验检测7A对VPCs自我更新和增殖,将VPCs细胞悬液稀释成10cells/ml,种入96孔板,每孔100ul,7天后染色观察集落形成情况。细胞transwell实验检测7A对VPCs迁移能力的影响。5.小肽7A对VPCs分化的影响VPCs在分化培养中自分化3天后,加入0.1ng/ml的小肽7S(7A的乱序对照小肽)、7A和PBS,加/不加5ng/ml VEGF。7天后,收细胞,提RNA,qPCR检测内皮细胞以及平滑肌细胞标志的表达。同时,分化7天后的细胞,种在Matrigel中,观察分化细胞血管形成能力。6.小肽7A影响VEGF诱导的VPCs迁移分化的机制研究6.1为了证明7A是否是促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶1(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1,MEKK1)与 14-3-3γ 磷酸化的信使,我们用SiRNA抑制VPCs中MEKK1的表达,在加入VEGF和7A的VPCs中检测磷酸化14-3-3γ的表达情况。6.2分别用SiRNA抑制MEKK1与14-3-3γ的表达,通过transwell实验观察VPCs迁移情况,分化实验检测其对VPCs分化的影响。7.小肽7A在体内修复血管损伤的作用研究7.1Matrigel血管形成模型:在C57BL/6J小鼠皮下注射15ul含有10ng/ml 7A的Matrigel,7天和14天分别将Matrigel取出,冷冻切片。免疫荧光染色观察CD31阳性细胞数量及分布。7.2股动脉导丝损伤小鼠模型:ApoE-/-小鼠股动脉导丝拉伤后,包裹含有10ng/ml7S、7A、7Ap(人工合成的丝氨酸被磷酸化的7A)或PBS的Pluronic-127胶。手术4周后,取股动脉,冷冻切片,HE染色分析新生内膜形成情况。7.3下肢局部缺血小鼠模型:C57BL/6J小鼠,一侧股动脉剪断并结扎,血管周围包裹含有10ng/ml7S、7A、7Ap或PBS的Pluronic-127胶。在手术后0,7,14天分别用多普勒检测下肢血流情况。14天后,取出损伤血管,冰冻切片,免疫荧光双染,观察CD31和Scal阳性细胞。结果1.VEGF 诱导 HDAC7mRNA可变剪接的发生通过观察免疫荧光染色结果,我们发现FLAG和HA可以在同一细胞中表达并且相互不重叠,说明sORF和主开放阅读框架都可以被独立翻译成蛋白。通过ELISA方法检测Ad-HD7FH病毒感染分化后的VPCs,发现VEGF处理显著增加FLAG的表达而降低HA的表达,使FLAG/HA的比例显著升高。说明VEGF促进VPCs中7A的表达。2.VEGF通过激活MEKK1导致7A的磷酸化免疫共沉淀实验结果发现,与对照病毒感染的细胞相比,Ad-HDAC7FH病毒感染的细胞anti-FLAG抗体的免疫共沉淀物中显示较高的磷酸化丝氨酸水平,VEGF处理显著增加其信号。考虑到免疫沉淀物中的磷酸化丝氨酸信号可以来自于7A的丝氨酸磷酸化也可以来自于7A结合蛋白的磷酸化。生物素标记7A(Bio-7A)/蛋白质沉淀实验结果表明7A的丝氨酸确实可以磷酸化,而且在VEGF处理下磷酸化程度增强。此外,7A磷酸化似乎由是氨基酸序列决定的,因为7A的同氨基酸乱序对照小肽7S(MPHASGD)不再被磷酸化。蛋白组学分析结果发现7Ap和7A+VEGF组检测到更多的激酶。更为重要的是,我们发现7Aa(7A丝氨酸突变小肽)与磷酸化的MEKK1特异结合,并且在VEGF处理后显著增加,而其他多肽都没有检测到与磷酸化的MEKK1的结合。这个结果提示7Aa与MEKK1结合但是不能传递磷酸根从而使MEKK1保持其磷酸化,也就是说MEKK1可能就是7A磷酸化的激酶之一。我们证实7Aa在VEGF处理下结合了大量的磷酸化MEKK1。进一步的实验证明VEGF可以诱导MEKK1瞬时性磷酸化,峰值位于作用后10分钟。7A的存在促进磷酸化的MEKK1去磷酸化,相反7Aa促进MEKK1磷酸化的滞留。免疫荧光检测也进一步证实7A的促去磷酸化作用。这些实验结果说明MEKK1可能就是7A磷酸化的上游激酶。SiRNA介导的MEKK1敲减实验显示,当MEKK1蛋白被敲减后,VEGF对7A的磷酸化作用显著降低,从而证明MEKK1确实是7A磷酸化的上游激酶。3.磷酸化小肽7A可以直接将磷酸根传递给14-3-3γ蛋白蛋白组学分析结果发现14-3-3γ蛋白的一段磷酸化多肽RATVVESSEK在Bio-7Ap和VEGF处理的Bio-7A组中显著高于其他组,提示14-3-3γ可能是7Ap的下游靶蛋白。Western Blot实验证实Bio-7A和Bio-7Ap与14-3-3γ蛋白的物理性结合。为了探讨7A是否直接介入14-3-3γ蛋白的磷酸化,Bio-7A与VEGF处理的VPCs细胞裂解液孵育,并检测7A磷酸化。结果发现VEGF增加Bio-7A的磷酸化,但是经14-3-3γ蛋白孵育后磷酸化显著降低,提示被磷酸化的7A将获得的磷酸根传递给了 14-3-3γ。有意思的是在14-3-3γ蛋白中检测到苏氨酸磷酸化增加而不是丝氨酸,说明磷酸根是从7Ap的丝氨酸传递到14-3-3y蛋白的苏氨酸。这一结果在合成的7Ap与重组14-3-3γ蛋白直接孵育实验中进一步得到证实。在7A存在的情况下,VEGF以时间依赖性方式诱导14-3-3γ蛋白磷酸化。免疫荧光染色也证实7A对VEGF诱导的14-3-3γ蛋白磷酸化具有促进作用,磷酸化的14-3-3γ蛋白定位于细胞核内,而非磷酸化的14-3-3γ蛋白定位于细胞质。这些结果说明7A可以传递磷酸根给14-3-3γ蛋白进而引起该蛋白细胞内定位的改变。4.小肽7A促进VPCs自我更新和迁移有细胞平板克隆实验中,我们观察到7A及7Ap显著增加克隆形成数以及每个克隆里细胞数。我们同时发现在7A和7Ap组相邻细胞之间的间隙比其它组细胞之间的大,提示在这两组中细胞迁移能力增加。在transwell迁移模型中,我们发现7A可以增强VEGF诱导VPCs的迁移,而7Ap自身就具有很强的促迁移作用,堪比7A+VEGF的共同作用。7A和7Ap对VPCs细胞迁移的影响在致密细胞单层伤口愈合实验中得到进一步的证实。5.小肽7A促进VEGF诱导的VPCs向内皮细胞分化RT-PCR检测血管内皮细胞和平滑肌细胞标志物的表达,发现7A尤其是7Ap显著增加CD31和CD144的表达,显著降低SM22的表达。说明7A可能作为VEGF下游的效应分子促进VPCs向血管内皮细胞方向分化而抑制平滑肌细胞分化。血管形成实验进一步证实了这些结果也同时表明这些分化的内皮细胞具有功能性的。6.MEKK1-7Ap-14-3-3γ信号通路参与VEGF诱导的VPCs迁移和分化7A可以从MEKK1接受磷酸根,而磷酸化的7A又可以把磷酸根传递给14-3-3γ蛋白。为了证明MEEK1和14-3-3γ蛋白具有上下游关系,我们实施了MEKK1敲减实验。MEKK1的敲减抑制了 VEGF诱导的14-3-3γ蛋白的磷酸化,说明14-3-3γ蛋白的磷酸化来源于MEKK1。7A从MEKK1处获得磷酸根并转而传递给14-3-3γ蛋白,从而形成一个MEKK1-7A-14-3-3γ的信号通路。在MEKK1和14-3-3γ敲减的VPCs进行迁移实验和分化实验。在MEKK1或14-3-3γ被敲减的细胞中VEGF失去了其促迁移及向内皮细胞分化的作用,表明MEKK1和14-3-3了都是VEGF诱导迁移及分化所必需的;7A增强的VEGF的作用完全消失,说明7A介导的VPCs迁移及分化也需要MEKK1和14-3-3γ的参与。在MEKK1被敲减的细胞中,7Ap仍然具有促进VPCs迁移分化的作用且不需要VEGF的参与,但是该作用在14-3-3γ被敲减的情况下消失,说明14-3-3γ是7Ap的下游效应分子。这些结果充分说明MEKK1-7A-14-3-3γ信号通路介导VEGF的促迁移及向内皮细胞分化作用。7.小肽7A促进缺血组织血管生成,对血管的损伤修复有积极作用Matrigel小鼠模型发现,7天时,PBS组几乎没有CD31阳性细胞,7S组有很少量的CD31阳性细胞,而7A组有大量CD31阳性细胞形成。14天后,PBS和7S组有少量CD31阳性细胞,但没有血管结构形成。相反,7A组则有较多的血管结构形成。股动脉导丝损伤模型,HE染色表明7A或7Ap的小鼠血管内皮完整,新生内膜显著降低。后肢缺血模型结果显示7Ap具有显著的促进血流恢复的作用,免疫荧光双染色的结果表明7Ap不仅促进Scal+祖细胞集落的形成而且促进其分化成CD31+细胞,形成新的毛细血管。这可能是7Ap促进血流恢复的原因。结论:1.VEGF促进HDAC7 mRNA5’端短阅读框架的翻译,产生小分子多肽7A.2.VEGF激活MEKK1磷酸化,而磷酸化的MEKK1又将7A丝氨酸位点磷酸化形成7Ap。7Ap可以将丝氨酸上的磷酸根传递给14-3-3γ的145位苏氨酸残基,并导致磷酸化14-3-3γ蛋白的核转移。从而形成MEKK-7A-14-3-3γ信号通路。3.小分子多肽7A作为一个磷酸根传递信使,参与VPCs自我更新,增殖,迁移,以及分化等多种细胞生理过程。4.小肽7A促进缺血组织血管生成,对血管的损伤修复有积极作用。