论文部分内容阅读
目的：研究miRNA-let-7a在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的皮肤黑素瘤组织和黑素瘤细胞系A375中的表达,探讨miRNA-let-7a对黑素瘤细胞系A375细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制；研究BRAF蛋白在黑素瘤细胞系A375和原代黑素细胞的表达差异,探索miRNA-let-7a对黑素瘤发病中关键蛋白BRAF的作用.方法：选取福尔马林固定石蜡包埋的黑素瘤组织13例,先天性色素痣组织10例,培养黑素瘤细胞系A375和原代黑素细胞,分别采用High Pure miRNA Isolation试剂盒和RNAiso Plus抽提miRNA及总RNA,逆转录为cDNA,用Taqman MGB探针和相应的引物,在ABI Prism 7500荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR.对SDS软件生成的数值进行计算和统计学分析.蛋白质印迹法检测BRAF蛋白在黑素瘤细胞系A375及原代黑素细胞的表达差异.应用cy3标记的siRNA转染A375细胞,荧光显微镜下观察转染效率.利用has-let-7a的模拟物及其阴性对照分别瞬时转染黑素瘤细胞系A375,CCK-8实验计算转染后两组细胞增殖的差异,流式细胞术检测两组细胞凋亡的不同,免疫印迹实验分析两组细胞Caspase-3(半胱天冬酶-3)蛋白和BRAF蛋白的表达差异.结果：从福尔马林固定石蜡包埋的组织中成功抽提出miRNA,实时荧光定量PCR结果显示miRNA-let-7a在FFPE黑素瘤组织中的表达明显低于先天性色素痣组织(P＜0.05),在黑素瘤细胞系A375中的表达明显低于原代黑素细胞.荧光显微镜下观察可见siRNA的转染效率约80～90％.与阴性对照相比,50nM的has-let-7a模拟物转染A375细胞后,miRNA-let-7a的表达升高2.067倍.采用miRNA-let-7a的模拟物转染后,与阴性对照相比,A375细胞增殖受抑,细胞凋亡增加(P＜0.05).与黑素细胞相比,BRAF蛋白在黑素瘤A375细胞系表达升高；与阴性对照相比,miRNA let-7a的模拟物转染A375细胞系后,caspase-3蛋白和BRAF蛋白表达均下降.结论：FFPE组织适合用来研究miRNA在黑素瘤中的表达,miRNA-let-7a在黑素瘤中表达下调,过表达miRNA-let-7a可抑制黑素瘤细胞系A375细胞的增殖并促进其凋亡,促进凋亡的机制可能与miRNA-let-7a下调caspase-3有关.黑素瘤发病中的关键蛋白BRAF在黑素瘤细胞系A375中的表达明显高于原代黑素细胞,miRNA-let-7a可下调BRAF蛋白的表达.总之,miRNA-let-7a可能在黑素瘤的发病中发挥抑癌基因的作用,有望成为黑素瘤早期诊断指标和治疗靶点.