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目的:检测2005年10月至2006年4月间华西医院临床分离的120株头孢菌素耐药的肠杆菌科细菌qnrA、qnrB的分布,同时研究qnr阳性菌株与bla<,SHV>、bla<,CTX-M>或质粒型AmpC酶基因的关系,为质粒介导的喹诺酮耐药机制(PMQR)的进一步研究提供实验依据。
方法:采用碱裂解变性法提纯质粒DNA,PCR法检测qnrA和qnrB的存在,反应条件为94℃变性45s、53℃退火45s、72℃延伸1分,32个循环。参考菌株包括肺炎克雷伯菌UAB1(qnrA)及大肠埃希菌J53/pMG298(qnrB)。采用接合实验验证qnr的转移性,受体菌为大肠埃希菌J53 Az,选择平板为含100μg/mL叠氮钠、100μg/mL氨苄西林、8μg/mL头孢噻肟的TSA琼脂(Difco公司)。扩增qnrB全序列,PCR产物经Axy Prep NDA Gel Extraction kit(Axygen Biosciences Cop.)纯化后由Invitrogen公司测序。对qnr阳性菌株携带患者,收集同一患者后续分离到的不同菌种进行PCR检测、质粒接合验证等以了解在患者体内是否存在qnr的水平转移。对所有qnr阳性菌株,采用Nitrocefin法检测供体菌产β-内酰胺酶情况,Multiplex-PCR法检测bla<,SHV>、bla<,CTX-M>及多种质粒型AmpC酶的bla基因。
结果:120株肠杆菌科细菌中,qnrA、qnrB的检出率分别为30.8％与27.5％,其中13株(10.8％)细菌同时包含qnrA、qnrB;肠杆菌属、克雷伯菌属细菌及大肠埃希菌qnr的检出率分别为52.9％、57.1％和50.0％。除1株肺炎克雷伯菌外所有qnr阳性菌株均能成功接合,而仅1株接合子在含环丙沙星的TSA上不能生长。17株细菌可扩增出681bp的全序列片段。测序结果显示,部分菌株包含qnrB1;但另有4株细菌包含相似的序列,与qnrB3有99％的同源性,存在3个位点核苷酸序列突变(201 A→T,271位T→G,498位G→A)而导致相应编码蛋白的氨基酸存在两个位点差异。6个患者后续分离到的7株细菌中6株均检出qnr基因,且对同一患者后续分离到的菌株与首次检出株含有一致的qnr基因。所有qnr阳性细菌均可使Nitrocefin纸片变红。49株(89.1％)qnr阳性细菌包含bla<,SHV>或bla<,CTX-M>,其中约半数细菌可同时检测到bla<,SHC>、bla<,CTM-M>。qnrB阳性者与bla<,SHV>关系密切。70.0％的qnr阳性菌可检测到质粒型AmpC β-内酰胺酶相关的bla基因,以DHA型及MIR-1T、ACT-1型为主。33株(60.0％)细菌同时包含编码AmpC型及SHV或CTX-M型β-内酰胺酶的基因。
结论:2005年10月-2006年4月我院临床存在qnr阳性菌株的流行,本研究在我国大陆首次检出qnrB,发现一种新的qnrB样基因亚型并注册GenBank。qnrB常与bla<,SHV>或bla<,CTX-M>、bla<,DHA>关系密切。此外,qnr在体内外均存在水平传播。