【摘 要】
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γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然的非蛋白质氨基酸,广泛分布于细菌、真菌、高等植物和哺乳动物中,具有降低血压、镇定安神、预防癫痫等多项重要生理功能,在食品及医药领域有着广阔的应用价值.GABA可通过化学合成法、生物提纯法及微生物发酵法制备.目前,筛选或构建优良高产的安全菌种用于发酵法制备GABA已获得共识.本文以食品工业及医药领域中应用广泛的公认安全的食品级微生物乳酸乳球菌为材料,通过代谢工程手段
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γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然的非蛋白质氨基酸,广泛分布于细菌、真菌、高等植物和哺乳动物中,具有降低血压、镇定安神、预防癫痫等多项重要生理功能,在食品及医药领域有着广阔的应用价值.GABA可通过化学合成法、生物提纯法及微生物发酵法制备.目前,筛选或构建优良高产的安全菌种用于发酵法制备GABA已获得共识.本文以食品工业及医药领域中应用广泛的公认安全的食品级微生物乳酸乳球菌为材料,通过代谢工程手段改造乳酸乳球菌L.lactis NZ9000,使其过量表达L.lactissubsp.lactis CV56的gadB基因,并考察了重组菌株合成GABA的能力.根据GenBank中L.lactis subsp.lactis CV56的gadB基因序列,设计特异性引物,进行PCR扩增,获得长度为1401 bp的DNA片段.构建重组质粒pNZ8148-gadB,并通过电击转化法导入L.lactis NZ9000中,经氯霉素平板筛选后挑选阳性转化子并测序验证,获得重组工程菌株NZ9000(pNZ8148-gadB).重组菌株经nisin诱导后,SDSPAGE电泳结果显示其在53 kDa处有一特异性条带,表明重组GAD得到表达.在30℃下于含有20 g/L底物L-谷氨酸钠的MRS液体培养基中静置发酵50 h后,重组菌株GABA产量为对照菌株的7.25倍.为探究重组菌株的最适发酵条件,进一步考察了pH、温度以及PLP添加量对菌体催化性能的影响.在选择不添加PLP,pH 4.4,50℃条件下,采用静息态细胞转化法,振荡反应25 h后GABA累积量高达34.73 g/L.
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