【摘 要】
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目的:筛选和核实甲状旁腺素(PTH)的非PLC依赖PKC信号转导途径(PTH/nonPLC/PKC)的效应基因,分析其对骨代谢的影响.方法:取2～3日龄C57BL乳鼠颅盖骨分离培养成骨细胞,取贴壁生长的第1代细胞,随机分为4组:100nmol/L[Gly1,Arg19]hPTH(1-28)+10nmol/L RP-cAMP:100nmol/L[Gly1,Arg19]hPTH(1-34)+10nmo
【机 构】
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南方医科大学南方医院脊柱骨科,广州 510515
【出 处】
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第十届中国南方骨质疏松论坛暨重庆市医学会骨质疏松年会
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目的:筛选和核实甲状旁腺素(PTH)的非PLC依赖PKC信号转导途径(PTH/nonPLC/PKC)的效应基因,分析其对骨代谢的影响.
方法:取2～3日龄C57BL乳鼠颅盖骨分离培养成骨细胞,取贴壁生长的第1代细胞,随机分为4组:100nmol/L[Gly1,Arg19]hPTH(1-28)+10nmol/L RP-cAMP:100nmol/L[Gly1,Arg19]hPTH(1-34)+10nmol/L RP-cAMP:10nmol/L PTH(1-34)及空白对照组加入等体积的0.1％三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),作用4h后,提取各组总RNA,行小鼠全基因组表达谱芯片分析,,筛选出可能与nonPLC/PKC信号转导通路相关的差异表达基因,并进行通路分析.RT-PCR筛选及验证上述差异表达基因.培养MC3T3-EI细胞,分为4组:[Gly1,Arg19]hPTH(1-28)+RP-cAMP:[Gly1,Arg19]hPTH(1-34)+RP-cAMP:[Gly1,Arg19]hPTH(1-34)+RP-cAMP+100 nmol/LGo6983; PTH(1-34)组及空白对照组(剂量同上),RT-PCR法验证ALP、CITED1是否为PTH的nonPLC/PKC信号转导通路的效应基因.
结果: 倒置相差显微镜观察示,培养7d见细胞排列紧密,为三角形或多边形,呈铺路石样;细胞培养14d ALP染色可见胞质中出现蓝染颗粒,成骨诱导培养28d茜素红染色可见红色矿化结节形成.基因芯片分析结果中筛选出与PTH的nonPLC/PKC信号转导通路相关性最大的56个基因,进行RT-PCR验证后发现ALP、CITED1的表达量在[Gly1,Arg19]hPTH(1-34)+RP-cAMP组显著高于[Gly1,Arg19]hPTH(1-28)+RP-cAMP组及空白对照组,但小于PTH(1-34)组(P＜0.05).MC3T3-EI细胞RT-PCR验证的结果 与其一致,且在加入PKC抑制剂(Go6983)后,ALP、CITED1的表达量明显下降(P＜0.05).
结论:PTH的nonPLC/PKC信号转导通路的激活能够使得ALP、CITED1的表达量明显升高,nonPLC/PKC通路在PTH调节骨代谢中的作用与ALP、CITEDI有关.
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