【摘 要】
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根据猪附红细胞体α-烯醇化酶基因序列,设计了1对特异性引物.利用SYBR Green Ⅰ染料进行Real-time PCR反应,经过对标准质粒的纯化和引物浓度的优化建立标准曲线.将质粒标准品用灭菌去离子水作107～100梯度稀释,各取1μL进行扩增,进行敏感性试验.应用SYBR Green荧光定量PCR方法分别检测猪附红细胞体、弓形虫、猪链球菌、猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸综合症病毒等的DNA样本,
【机 构】
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延边大学农学院,吉林,延吉 133002
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会
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根据猪附红细胞体α-烯醇化酶基因序列,设计了1对特异性引物.利用SYBR Green Ⅰ染料进行Real-time PCR反应,经过对标准质粒的纯化和引物浓度的优化建立标准曲线.将质粒标准品用灭菌去离子水作107～100梯度稀释,各取1μL进行扩增,进行敏感性试验.应用SYBR Green荧光定量PCR方法分别检测猪附红细胞体、弓形虫、猪链球菌、猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸综合症病毒等的DNA样本,从而进行特异性试验.并进行组内、组间和稳定性试验.荧光定量PCR判定标准为：1、标准品的扩增曲线呈S型,在35个循环前检测到荧光信号,阴性对照检测不到荧光信号,且熔解曲线只出现单一峰；2、检测样本Ct值小于30为阳性,Ct值大于35为阴性,Ct值介于30-35之间为可疑样本,需进行重复试验.重复试验后,如仍在此期间则判定为阴性.根据该标准应用已建立的方法和常规PCR方法对49份临床样本进行平行检测.结果显示,标准曲线的反应相关系数为0.894,检测极限约为1.44拷贝/μL.特异性试验表明只有猪附红细胞体能检测到特异性的熔解度峰值,而弓形虫、猪链球菌、猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸综合症病毒等DNA样本未检测到特异性的熔解度峰值.组内变异系数、组间变异系数和稳定性系数的CV值均小于5％.临床样本检测结果显示所建立的荧光定量PCR方法检测的阳性率(40.8％)比常规PCR方法检测的阳性率(30.6％)高10.2％.结果表明,本研究所建立的α-烯醇化酶基因实时荧光定量PCR方法灵敏度高,特异性强,稳定性好建议推广应用.猪附红细胞体SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立将为以后猪附红细胞体病的诊断和防治提供重要的技术支持.
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