同源重组是基因打靶的分子基础,但是细胞内发生同源重组的频率非常低.本研究组近年来从事基因打靶研究,建立了高效多位点基因打靶技术.该技术以rRNA基因间的内部转录间隔重复序列为靶位点,可使外源基因位于活跃的转录单位内,且使基因定点整合效率相应提高200-300倍.CRISPR/Cas9系统是细菌在噬菌体长期选择压力下进化出来的一种有效抵御外源DNA入侵的免疫机制.在细菌细胞内,CRISPR簇在其前导区的调控下转录成precrRNA,然后在tracrRNA和Cas9参与下成为加工成熟的crRNA,并引导crRNA/tracrRNA/Cas9复合体识别结合外源DNA特定序列,剪切DNA双链,沉默外源基因的表达.基于此种原理,CRISPR/Cas9系统被开发成一种新型的基因打靶系统.CRISPR/Cas9系统由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物,它对靶点的识别依赖于RNA对靶DNA序列的识别,识别作用通过碱基的互补配对完成.对一个具体的DNA位点进行基因打靶,只需要在原有gRNA核心序列的基础上添加21 bp长度的核苷酸序列作为引导序列即可,此引导序列的的3端必须存在PAM序列(NGG).因此,在gRNA核心序列上添加引导序列的构建过程极为简单和快捷.通过生物信息学分析,本研究组在水牛细胞的rRNA基因间的内部转录间隔序列中,确定了适合gRNA识别并结合Cas9进行切割的位点,并针对该位点,根据gRNA的序列特征,设计了3条gRNA序列,并构建同时表达gRNA和Cas9的真核表达载体.此外,在gRNA识别的靶位点的两侧设计和扩增两条基因打靶同源引导序列DS1和DS2,将DS1,DS2以及EGFP基因分别插入pUC19载体中,构建成多位点基因打靶载体pUC19-DSl-EGFP-DS2.利用多位点基因打靶载体结合gRNA和Cas9的表达载体,可以在水牛细胞中进行初步的CRISPR/Cas9诱导的多位点基因打靶研究,将有可能为水牛转基因研究提供高效定点转基因方法.